Ferramentas moleculares para detecção de agentes da cromoblastomicose do gênero Fonsecaea

Abstract

Resumo: Leveduras negras pertencentes à ordem Chaetothyriales, família Herpotrichiellaceae, abrangem diversas espécies associadas a colonização de hospedeiros humanos e animais, tal como relatado nos gêneros Exophiala, Cladophialophora, Capronia, Fonsecaea, Phialophora, Rhinocladiella, Veronea e Cyphellophora, sendo que entre as principais micoses causadas por este grupo destacam-se a cromoblastomicose e a feoifomicose. Nesta família existem espécies proximamente relacionadas com características morfológicas muito semelhantes, assumidas como espécies crípticas com ecologia diferente, reunindo desde sapróbias a patógenas. Diante disto, o presente trabalho objetivou desenvolver novos métodos moleculares capazes de identificar ferramentas para diferenciação e detecção de espécies crípticas, agentes causais de cromoblastomicose, uma micose de implantação, com forte ligação ambiental, causada por várias espécies de leveduras negras. Logo, a utilização de técnicas moleculares com maior sensibilidade, especificidade e eficácia, como o uso de sondas cadeado aliado à técnica de amplificação em círculo rolante (RCA), pode influenciar intrinsicamente no diagnóstico, em estudos de virulência e epidemiologia molecular, assim como no entendimento de vias de infecção, levando a identificação da espécie mesmo sem estudos de sequenciamento genômico. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo desenhar oligonucleotídeos espécie específicos para as espécies de Fonsecaea patogênicas como F. monophora, F. nubica, F. pedrosoi e F. pugnacius e a sonda cadeado baseada na amplificação de circulo rolante (RCA), para a espécie F. pugnacius. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados para as espécies F. pedrosoi (FOPE), F. monophora (FOMO), F. nubica (FONU) e F. pugnacius (FOPU), utilizando como molde a região do gene CBF5 (centromere/microtubule-binding protein cbf5) e a sonda RCA cadeado para F. pugnacius (FPgP) utilizando como molde a região ITS1-5,8S-ITS2 do DNAr, com 94pb. Estas ferramentas demonstraram especificidade quanto as espécies de Fonsecaea em ensaios in silico e in vitro, comparando espécies de origem clínica ou ambiental (F. pedrosoi, F. monophora, F. nubica, F. pugnacius, F. erecta e F. brasiliensis), além das demais espécies associadas à cromoblastomicose como Cladophialophora carrioni, C. samoensis, E. dermatitidis, P. verrucosa, R. aquaspersa, R. tropicalis e Cyphellophora ludoviensis. Palavras-chave: Cromoblastomicose. Detecção molecular. Oligonucleotídeos espécie-específico. Sonda cadeado RCA. Fonsecaea pugnacius.

Abstract: The black yeasts from the Herpotrichiellaceae family of the Chaetothyriales order belong to several genus such as Exophiala, Cladophialophora, Capronia, Fonsecaea, Phialophora, Rhinocladiella, Veronea and Cyphellophora with related species associated to infection in human and animal hosts; as for instance the casual agents of Chromoblastomycosis and phaeohyphomycosis. In the Herpotrichiellaceae family there are from saprobes to pathogens strains described as closely related species very similar in morphology but different in ecology. In this context, there is a necessity to develop new molecular methods capable to species discrimination and environmental and biological samples detection, especially for the causative agents of chromoblastomycosis, an implantation mycosis, with an important environmental link. Given that, the use of molecular techniques with high sensitivity, specificity and efficacy, such as the use of padlock probes associated to rolling circle amplification technique (RCA), represent a potential effective tool for diagnosis, virulence and molecular epidemiology studies. Likewise it could be useful for infection routes elucidation and species identification even without genomic sequencing. Therefore, this work aimed to design molecular markers species-specific for Fonsecaea pathogenic species as F. monophora, F. nubica, F. pedrosoi and F. pugnacius and develop a padlock probe RCA for F. pugnacius. Species-specific primers were designed for F. pedrosoi (FOPE), F. monophora (FOMO), F. nubica (FONU) and F. pugnacius (FOPU) using CBF5 gene (centromere microtubule-binding protein cbf5 ) and the RCA padlock probe (FPgP), for F. pugnacius using region ITS1-5.8S-ITS2 of rDNA as template, with 94pb. These tools demonstrated specificity for Fonsecaea sibling species in the in silico and in vitro assays using the clinical and environmental species: F. pedrosoi, F. monophora, F. nubica, F. pugnacius, F. erecta and F. brasiliensis in comparison to other associated with chromoblastomycosis such as C. carrioni, C. samoensis, E. dermatitidis, P. verrucosa, R. aquaspersa, R. tropicalis and Cyphellophora ludoviensis. Keywords: Chromoblastomycosis. Molecular detection. Species-specific primers. RCA padlock probe. Fonsecaea pugnacius.