Fracionamento e caracterização estrutural de compostos presentes no extrato aquoso da microalga Scenedesmus subspicatus e sua potencial atividade bioestimulante vegetal

Abstract

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo a caracterização química de compostos bioativos extraídos da microalga verde Scenedesmus subspicatus Chodat, assim como a determinação da atividade bioestimulante vegetal dessas moléculas. A microalga foi cultivada em meio Guillard f/2 modificado durante 10 dias, e uma alíquota de cultivo foi coletada em dias alternados para determinação do perfil de produção de carboidratos ao longo do crescimento celular. Observou-se que o maior acúmulo se deu na fase estacionária de crescimento, sendo esta a fase ideal para que o cultivo seja interrompido. A biomassa seca foi obtida após separação do meio de cultivo por centrifugação e liofilização. O material foi submetido a três extrações sequenciais, sendo a primeira aquosa em temperatura ambiente (10%, 1 h), a segunda aquosa em temperatura de 80°C (10%, 2 h), e a terceira alcalina (NaOH 0,5 M, 2 h) em temperatura de 80°C. O extrato aquoso obtido em temperatura ambiente foi dialisado em membrana de 1 kDa, e gerou as frações E (eluída) e R (retida). O extrato aquoso obtido a 80°C foi submetido a precipitação com etanol, centrifugação e liofilização, gerando as frações solúvel (SEwh) e insolúvel (Pwh) em etanol. O extrato alcalino foi neutralizado e dialisado, e também foi submetido a precipitação com etanol, gerando as frações solúvel (SEak) e insolúvel (Pak). Com estas 6 frações, foram realizadas dosagens colorimétricas de carboidratos e proteínas, além de análise da composição monossacarídica. A atividade bioestimulante vegetal em sementes de tomate (Solanum lycopersicum) foi avaliada para as frações E bruta e Pak, em concentrações de 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 g/L para cada uma das amostras, tendo como controle a água e como padrão de comparação o produto comercial ACADIAN ™ Seaweed Extract (Ascophyllum nodosum). A fração Pak mostrou-se estatisticamente igual ao controle, portanto, esta não apresenta atividade bioestimulante. A fração E foi capaz de estimular o aumento do comprimento e do volume dos hipocótilos de forma estatisticamente igual ao produto comercial, mostrando-se como possível substituto. As análises químicas e espectroscópicas, assim como os processos de purificação, foram aprofundados com as frações E e Pak. A fração E foi submetida a fracionamento por cromatografia de exclusão (Bio-Gel P-2), gerando 6 subfrações nomeadas E1 a E6. Destas, E2, E3, E4, E5 e E6 foram caracterizadas por RMN de 1H, 13C, 13C-DEPT, COSY, TOCSY, HSQC e HMBC, e correspondem aos glicosídeos 6-sulfo-?-D-quinovopiranose-(1'1)-glicerol (E2 e E3), ?-D-galactopiranose-(1'6)-?-D-galactopiranose-(1'1)-glicerol (E4), ?-D-galactopiranose-(1'1)-glicerol (E5), e aos monossacarídeos D-manose e D-glucose (E6). As estruturas de E2, E4 e E5 foram confirmadas por ESI-MS, e o isolamento dos glicosídeos E4 e E5 na sua forma deacilada ainda não havia sido descrito para microalgas. As análises da fração Pak indicaram a presença de uma ?-glucana-(1'4) ligada (amilose), comum às microalgas verdes e vermelhas. Acredita-se que o efeito promotor do crescimento vegetal apresentado pela fração E seja influenciado, em parte, pelos glicosídeos e monossacarídeos isolados deste extrato. Palavras-chave: Microalgas. Glicosídeos. Polissacarídeos. Bioestimulante vegetal.

Abstract: The present study was performed on chemical characterization of bioactive compounds extracted from green microalgae Scenedesmus subspicatus Chodat, as well as its biostimulant activity in plants. Microalgae was cultured in Guillard f/2 modified media for 10 days, and an aliquot of culture was collected on alternate days to determine the carbohydrate production profile during cell growth. It was observed that the greatest concentration occurred in stationary phase, and this was the best phase for culture discontinuance. Dried biomass was obtained after separation of culture media by centrifugation and freeze-drying. Material was then submitted to three sequential extractions, the first was aqueous at room temperature (10%, 1 h), the second was aqueous at temperature of 80°C (10%, 2 h), and third was alkaline (NaOH 0,5 M, 2 h) at temperature of 80°C. Aqueous extract (room temperature) was dialyzed in a membrane of 1 kDa cut off, and yielded fraction E (eluted) and R (retained). Aqueous extract (80°C) was submitted to ethanol precipitation, centrifugation and freeze-drying, yielding soluble fraction (SEwh) and insoluble (Pwh) in ethanol. Alkaline extract was neutralized and dialyzed, and also submitted to ethanol precipitation, centrifugation and freeze-drying, yielding soluble fraction (SEak) and insoluble (Pak) in ethanol. With these 6 fractions, colorimetric measurements of carbohydrates and proteins, as well as monosaccharide composition analysis were performed. Plant biostimulant activity in tomato seeds (Solanum lycopersicum) were performed for crude fraction E and Pak, at concentrations of 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 g/L for each sample, having water as control and ACADIAN ™ Seaweed Extract (Ascophyllum nodosum) as commercial product for comparisons. Pak fraction showed statistically equal to control, therefore, it does not present biostimulant activity. Fraction E was capable to stimulate higher length and volume of hypocotyls, statistically equal to commercial product, showing up as a possible substitute. Chemical and spectroscopy analysis, as well as purification processes were deepened with E and Pak fractions. Fraction E was submitted to exclusion chromatography fractionation (Bio-Gel P-2), yielding 6 subfractions named E1 to E6. Of these, E2, E3, E4 and E5 were characterized by 1H, 13C, 13C-DEPT, COSY, TOCSY, HSQC and HMBC NMR, and correspond to glycosides 6-sulfo-?-D-quinovopyranose-(1'1)-glycerol (E2 and E3), ?-D-galactopyranose-(1'6)-?-D-galactopyranose-(1'1)-glycerol (E4), ?-D-galactopyranose-(1'1)-glycerol (E5), and the monosaccharides D-mannose and D-glucose (E6). E2, E4 and E5 structures were confirmed by ESI-MS, and isolation of E4 and E5 glycosides in deacylated form had not yet been described for microalgae. Analysis of Pak fraction indicated the presence of an ?-glucan-(1'4) linked (amylose), common to green and red microalgae. It is believed that the plant growth stimulus presented by fraction E is influenced, in part, by glycosides and monosaccharides isolated from this extract. Key-words: Microalgae. Glycosides. Polysaccharides. Plant biostimulant.