Caracterização da glutamina sintetase da estirpe excretora de amônio HM053 de Azospirillum brasiliense

Abstract

Resumo: O nitrogênio é um elemento macro essencial para os organismos vivos. O gás nitrogênio (N2), presente em grandes quantidades na atmosfera, é uma forma biologicamente indisponível para a maioria dos organismos. As bactérias diazotróficas, como Azospirillum brasilense, podem converter N2 em formas prontamente disponíveis, como o amônio, através da fixação de nitrogênio. O amônio produzido é usado para a síntese de glutamina em uma reação catalisada pela glutamina sintetase (GS), esse produto é convertido em outros compostos de nitrogênio. O gene glnA de Azospirillum brasilense HM053 tem uma mutação pontual (citosina para timina na posição 1040) que codifica uma glutamina sintetase com atividade muito baixa. Acredita-se que, devido à baixa atividade desta enzima, o amônio produzido pela nitrogenase não é totalmente assimilado e, como consequência, HM053 excreta parte do amônio produzido. Este trabalho caracteriza a GS mutante do Azospirillum brasilense HM053. Os genes glnA da estirpe mutante e da estirpe selvagem foram clonados em pET28a. Os plasmídeos recombinantes foram utilizados para superexpressar GS em E. coli e as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna HiTrap-Chellating. A GS também foi extraída e purificada diretamente da bactéria do tipo selvagem de A. brasilense. As proteínas purificadas foram caracterizadas por SDS PAGE/western blot e MALDI-TOF espectrometria de massa. Os resultados mostraram que a GS do HM053 (P347L) tem baixa atividade e é indiferente à adenililação, se mantendo desadenililada. A mutação P347L localizada distante do sítio ativo e do sítio de adenililação pode ter causado mudanças estruturais na GS, afetando sua atividade e adenililação. Palavras-chave: Fixação de nitrogênio. Glutamina sintetase. Azospirillum brasilense. Gene glnA

Abstract: Nitrogen is an essential macro element for living organisms. Nitrogen gas (N2), present in vast quantities in the atmosphere, is a form biologically unavailable for most organisms. Diazotrophic bacteria, such as Azospirillum brasilense, can convert N2 to readily available forms, such as ammonium, through nitrogen fixation. The ammonium produced is used for the synthesis of glutamine in a reaction catalyzed by glutamine synthetase (GS), the product is converted to other nitrogen compounds. The glnA gene of Azospirillum brasilense HM053 has a point mutation (cytosine to thymine at position 1040) encoding a glutamine synthetase with very low activity. It is believed that due to the low activity of this enzyme, the ammonium produced by the nitrogenase is not totally assimilated and, as a consequence, HM053 excretes part of the ammonium produced. This work characterizes the GS mutant of Azospirillum brasilense HM053. The glnA genes of the mutant strain and the wild strain were cloned into pET28a. The recombinant plasmids were used to overexpress GS in E. coli and the proteins were purified by affinity chromatography on HiTrap-Chellating column. The GS was also extracted and purified from A. brasilense wild type. The purified proteins were characterized by SDS PAGE/western blot and MALDI-TOF mass spectrometry. The results showed that the HM053GS (P347L) has low activity and insensitive to adenylylation, remaining disadenylated. The mutation P347L located distant from the active and adenylylation sites might caused structural change in GS affecting its activity and adenylylation. Keywords: Nitrogen fixation. Glutamine synthetase. Azospirillum brasilense. Gene glnA