Caracterização da interação entre a proteína prion e a vimentina

Abstract

Resumo: A proteína prion celular, ou PrPC, é uma proteína ancorada externamente à membrana plasmática por uma molécula de glicofosfatidilinositol. Sua conversão de uma forma fisiológica para uma isoforma mal dobrada e infecciosa, denominada scrapie, é responsável pelo aparecimento das doenças priônicas, também conhecidas como Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis. Para elucidar as funções fisiológicas de PrPC, são realizados estudos para se descobrir seus possíveis parceiros moleculares. Recentemente, resultados obtidos por nosso grupo identificaram dez possíveis ligantes para PrPC, dentre os quais destaca-se a vimentina, uma proteína de filamento intermediário. Em células com quantidade excessiva de proteína mal dobrada ou com inibição de proteassoma, há a formação de agressomos, estruturas pericentriolares com agregados de proteínas em seu centro e envoltos por uma gaiola de filamentos intermediários compostos principalmente por vimentina. Para esmiuçar a relação entre as proteínas PrPC e vimentina, verificar a formação de agressomos e suas possíveis consequências para as células, fizemos experimentos de Pull-Down, imunofluorescência, Western Blot, solubilidade em metanol e MTT em células HeLa e N2a. Foram testados tratamentos com DMSO, MG132 e Ciclosporina A (CsA), e transfecções com plasmídeos expressando GFP, GFP-PrPC, GFP-PrPcy, e mutantes de PrPC P104L e V179I. A interação entre as proteínas prion celular e vimentina pôde ser confirmada in vitro pela técnica de Pull-Down nas células HeLa. Inesperadamente, a viabilidade celular de HeLa e N2a não pareceu ser afetada por nenhum dos tratamentos testados. Nas imunofluorescências com ambas as células foi possível observar a formação de agressomos, principalmente nos tratamentos com MG132 e CsA, sendo o primeiro um inibidor de proteassoma e o segundo um inibidor da via das ciclofilinas. A formação desses agressomos parece estar ligada a uma redução na expressão de vimentina de ambas às células, e a um aumento da insolubilidade da proteína prion nas células N2a, mas não nas células HeLa. Palavras chave: Prion. Vimentina. Agressomos. Scrapie.

Abstract: The cellular prion protein, or PrPC, is a protein anchored to the external leaflet of the plasma membrana by a glycophosphatidylinositol molecule. Its conversion from a physiological isoform to a misfolded and infeccious one, named scrapie, is responsible for the prionic diseases, also known as Transmissible Spongiform Encephalopathies. To elucidate the physiological functions of PrPC, studies are conducted to discover its possible molecular partners. Recently, studies done by our group found ten possible ligants for PrPC, among of them is the vimentin, a intermediate filament protein. In cells showing high levels of misfolded proteins or with proteasome inhibition, there is the formation of aggresomes, pericentriolar structures with protein aggregates on its center wrapped by a cage of intermediate filaments composed mostly by vimentin. To deeply investigate the relation between PrPC and vimentin proteins, to verify the formation of aggresomes and its possible consequences to the cells, we did Pull-Down, immunofluorescence, Western Blot, methanol solubility and MTT experiments in HeLa and N2a cells. We tested treatments with DMSO, MG132 and Cyclosporine A (CsA), and transfections with plasmids expressing GFP, GFP-PrPC, GFP-PrPcy, and PrPC mutants P104L and V179I. The interaction between cellular prion protein and vimentin could be confirmed in vitro by the Pull-Down technique in HeLa cells. Unexpectedly, the HeLa and N2a cell viability was not affected by none of the tested treatments. Immunofluorescence with both cells showed the formation of aggresomes, mainly in MG132 and CsA treatments, the first being a proteasome inhibitor and the second a cyclophilins route inhibitor. The formation of these aggresomes seems to be linked to a reduction in vimentin expression in both cells, and to an increase in insolubility of prion protein in N2a cells, but not in HeLa cells. Keywords: Prion. Vimentin. Aggresomes. Scrapie.