Sinvastatina induz o processo autofágico em células de melanoma humano metastático : potencial ação na resistência tumoral

Abstract

Resumo: O melanoma é um tipo de câncer de pele que possui baixa incidência, porém é muito agressivo e com alto índice de mortalidade. Vale destacar que um dos grandes desafios da terapêutica atual é a ocorrência do processo de resistência. O mecanismo de resistência tumoral é complexo e, em geral, acontece porque as células tumorais sofrem mutações, amplificações ou superexpressões de genes regulatórios ou por modulação de mecanismos compensatórios (como senescência e autofagia) que produzem a resistência. A condição de resistência propicia aumento da tolerância das células tumorais aos efeitos citotóxicos do fármaco e/ou ativa sinais de sobrevivência nas mesmas. Esses fatos enfatizam a necessidade da busca por novas alternativas de tratamento que sejam mais eficientes e que superem os mecanismos de resistência tumoral. A sinvastatina é um fármaco da classe das estatinas utilizado para o tratamento de dislipidemias. Atualmente, sabe-se que possui ação antitumoral, capaz de induzir apoptose,parada do ciclo celular e modular o processo de autofagia em diversas linhagens de tumores. A relação entre autofagia e apoptose é controversa, pois, a autofagia ora é tratada como mecanismo capaz de suprimir o desenvolvimento do tumor, ora capaz de promover o tumor fornecendo substratos da degradação decomponentes celulares. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da sinvastatina na modulação da autofagia em células de melanoma metastático humano da linhagem WM9. Nossos resultados mostram que a sinvastatina é capaz de reduzir a viabilidade das células WM9 e WM1617 de forma dependente da concentração, atingindo 53,5 % e 90,3 % (pelo método de MTT) após tratamento das células com sinvastatina nas concentrações de 1 ?M e 5 ?M,respectivamente. A redução de viabilidade foi acompanhada por aumento no índice autofágico em torno de 2,5 unidades para o tratamento na concentração de5 ?M de sinvastatina e aumento da quantidade de células na fase G0-G1 do ciclo celular de forma dependente da concentração. O co-tratamento de sinvastatina com o inibidor de autofagia hidroxicloroquina promoveu inibição efetiva do processo autofágico, com concomitante aumento da sensibilidade das célulasWM9 aos efeitos citotóxicos da sinvastatina, promovendo redução mais expressiva da viabilidade celular (atingindo 97% com a combinação sinvastatina/hidroxicloroquina, 5?M/25?M), acompanhada de aumento da quantidade de células com DNA fragmentado (atingindo 18,4% com a combinação). Para melhor compreender o mecanismo de ação da sinvastatina,foram avaliados dois marcadores chaves do processo autofágico: LC3-I/II e p62.Pode-se observar níveis aumentados da expressão de LC3-I/II proporcional ao aumento da concentração de sinvastatina e concomitante redução dos níveis de proteína p62. Quando o processo autofágico foi inibido pelo uso da hidroxicloroquina observou-se que a expressão de LC3-I/II foi diminuída e os níveis de p62 não foram alterados. Ainda, foi observado que o número de células WM9com vacúolos fluorescentes (marcados com a proteína de fusão GFP-LC3)aumentam percentualmente com o aumento da concentração de sinvastatina utilizada nos tratamentos, fato que corrobora os resultados de expressão. Juntos,esses dados indicam que o tratamento das células WM9 com sinvastatina é capaz de induzir o processo autofágico de maneira concentração-dependente, sendo este um mecanismo de resistência tumoral em modelo de melanoma humano.Vale destacar que, independente do aumento no fluxo autofágico, a sinvastatina foi citotóxica, tornando interessante a possibilidade de ser utilizada como um agente terapêutico alternativo e/ou adjuvante ao uso de quimioterápicos.Palavras-chave: Melanoma, sinvastatina, autofagia.

Abstract: Melanoma is a type of skin cancer that has low incidence, but is very aggressive and with high mortality rate. One of the big challenges of the modern therapy is the occurrence of the resistance process. The tumor resistance mechanism is complex and usually happens because the tumor cells undergo mutations, amplifications or super expressions by regulatory genes or by modulation of compensatory mechanisms that produces resistance. The tumor resistance condition increases the tolerance of tumor cells to the cytotoxic effects of the drugand/or activate survival signals in tumor cells. These facts emphasize the necessity to look for new and more effective treatment alternatives that overcome the resistance mechanisms of tumor cells. Simvastatin is a drug of the statin class used for the treatment of dyslipidemia. Currently, it?s known that have antitumor activity, capable of inducing apoptosis, cell cycle arrest and modulate the process of autophagy in several tumor lines. The link between autophagy and apoptosis is controversial because, autophagy is sometimes treated as a mechanism able to suppress tumor development, sometimes able to promote tumor providing degradation substrates. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of simvastatin on the modulation of autophagy in human metastatic melanoma cellsWM9 lineage. Our results demonstrate that simvastatin is able to reduce the viability of WM9 cell concentration dependent manner, reaching 53,5 % and 90,3 %(by MTT method) after treatment of cells with simvastatin at concentrations of 5?Mand 1?M, respectively. The decrease in viability was followed by an increase inautophagic index of about 2.5 units for the treatment at a concentration of 5 uM andsimvastatin increased amount of cells in the G0-G1 phase of the cell cycle concentration dependent manner. The co-treatment of simvastatin with the inhibitorhydroxychloroquine promoted effectively inhibition of the autophagic process, with concomitant increased sensitivity of WM9 cells to the cytotoxic effects of simvastatin, promoting more significant reduction in cell viability (97 %, simvastatin5?M/25?M hydroxychloroquine) accompanied by significant increase in the numberof cells with fragmented DNA (18,4 % simvastatin/hydroxychloroquine 5?M/25?M).To further understand the mechanism of the action of simvastatin capable of inducing autophagy, were evaluated two key markers of the autophagic process. Itcan be observed increased levels of expression of LC3-I/II proportional to the concentration of simvastatin and concomitant reduction of p62 protein levels. When the autophagic process was inhibited by the use of hydroxychloroquine it was observed that the expression of LC3-I/II was reduced, and p62 levels were unchanged. Confirming the results of expression, it was observed that the number of WM9 cells with fluorescent vacuoles (marked with LC3-GFP protein fusion)percentage increase with increasing concentration of simvastatin used in the treatments. Together, these results indicates that the treatment of cells withsimvastatin WM9 is capable of inducing the autophagic process in a concentration dependent manner, which is a tumor resistance mechanism in human melanoma model. Note that independent of the increase in autophagic flux simvastatin wascytotoxic, making interesting possibility to be used as an alternative therapeutic agent and/or adjuvant to chemotherapy. Key-Words: Melanoma, simvastatin, autophagy.