Desenvolvimento e validação de método por clae/em-em para quantificação de eicosanóides em meio de cultivo celular

Abstract

Resumo: A inflamação é uma resposta fisiológica natural do organismo à infecção, dano e ou stress celular, agindo como um mecanismo de defesa para remover e reparar o tecido danificado. Quimicamente este processo é modulado por mediadores inflamatórios, dentre eles os ácidos graxos insaturados derivados do ácido araquidónico denominados eicosanóides. A detecção e quantificação destes compostos é de grande interesse porque eles estão envolvidos em uma série de doenças, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), doença cardiovascular, câncer, entre outras. A cromatografia líquida de alta eficiência hifenada a espectrometria de massas sequencial (CLAE-EM/EM) tem emergido como uma das principais técnicas utilizadas para quantificar estes mediadores. Neste trabalho, um método foi desenvolvido e validado para a análise simultânea de cinco eicosanóides em meio de cultivo celular utilizando celulas RAW 264.7, e a técnica de CLAE-EM/EM. As separações cromatográficas foram realizadas em coluna ZORBAX Eclipse XDB, C-18 (4,6 x 50 mm 1,8 ?m) a temperatura de 40 ?C, e uma fase móvel, contendo água e acetonitrila ambas com ácido fórmico a 1%. O modo de eluição utilizado foi gradiente com um fluxo de 700?L.min-1. As amostras foram preparadas por extração líquido-líquido da matriz (meio DMEM) sem passos adicionais de limpeza. O método foi validado conforme normas nacionais e internacionais para métodos bioanaliticose mostrou-se ser seletivo, sensível (limite de detecção em 1 ng.mL-1 e limite de quantificação em 5ng.mL-1 para todos os compostos), linear (r2> 0,99,preciso (ER<7%),exato (CV<13%) e livre de efeitos residual e matriz (FMN> 1,25 ± 0,07). De acordo com o estudo de estabilidade os analitos são estáveis na matriz à temperatura ambiente durante 3 h. O ensaio de estabilidade pós-processamento indicou que as amostras armazenadas no injetor a 3 ° C mantém-se estáveis por 5 horas. Os analitos também mostraram-se estáveispor 3 horas a 22ºC em solução e por 20 dias a -40°C em solução e em matriz. Não houvedegradação significativa emtrês ciclos de congelamento e descongelamento. Este novo método permite a quantificação dos metabolitos do ácido araquidónico (PGE2, PGD2, 6-CETO-PGF1?, PGF2? e TXB2) a partir de meio de cultivo DMEM utilizando células RAW 264.7, sem derivatização ou passos laboriosos de purificação (EFS). Este método pode ser aplicado para avaliar a atividade anti-inflamatória de extratos de plantas utilizando cultivo de células. Palavras-chave: DMEM; Eicosanóides; RAW 264.7; CLAE-EM/EM

Abstract: Inflammation is the body's natural physiological response to infection or injury, acting as a defense mechanism to remove and repair damaged tissue. Chemically this process is modulated by inflammatory mediators such as eicosanoids, which are oxygenated, endogenous, unsaturated fatty acids derived from arachidonic acid. Detection and quantification of these compounds are of great interest because they play important roles in a number of significant diseases, including asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), cardiovascular disease, cancer among others. High-performance liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS/MS) has emerged as one of the main techniques used to quantify these mediators. In this work a validated method is described for the simultaneous analysis of five eicosanoids from cultured cells using liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS). Chromatographic separations were achieved on an ZORBAX Eclipse XDB C-18 column (4,6 x 50 mm 1.8 ?m) maintained at 40 ?C. The mobile phase was eluted at 700 ?L min-1 in gradient mode between Water/Acetonitrileboth containing 1% formic acid. The samples were prepared by liquid-liquid extraction of the matrix (DMEM medium) without additional cleanup steps. The method was validated according to national and international guidances, and shown to be sensitive (limit of detection at 1 ng.mL-1 and limit of quantitation at 5ng.mL-1 for all compounds), linear (r2> 0,99), free of residual and matrix (FMN> 1,25 ± 0,07) effects, accurate (RE<7%) and precise (RSD<13%). The stability study demonstrated that the analytes are stable in matrix at room temperature for 3h. The post-processing stability assay revealed that the samples stored in the sample manager at 3°C can be maintained for 5hours prior to injection. Under the evaluated conditions, the analytes and IS also demonstrated stability in solution for 3hours at room temperature, and -40ºC for 20 days. The freeze-thaw cycles assay showed that there was no significant degradation in three defrost cycles. This new method permits quantification of selected individual arachidonic acid metabolites from RAW 264.7 cell culture medium (DMEM), without derivatization or laborious purification steps (SPE) and shown to be applicable to evaluate the anti- inflammatory activity of plants extracts using cell culture. Keywords: DMEM; Eicosanoids; RAW 264.7; LC-MS/MS