Clonagem e expressão de proteína heteróloga com potencial imunogênico contra corynebacterium diphtheriae Kruse, 1886

Abstract

Resumo: O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma proteína recombinante com potencial imunogênico contra Corynebacterium diphtheriae, que possa ser utilizada como vacina de subunidade. A cepa de C. diphtheriae foi utilizada para clonagem do gene da subunidade B da toxina por ser a porção imunogênica da molécula. O produto da clonagem foi inserido no vetor de expressão pAE, e amplificado em Escherichia coli DH5 alfa. Para a expressão da proteína, o plasmídeo contendo o inserto foi transfectado em E. coli BL21 pLysS. As melhores condições de expressão da proteína recombinante foram 31ºC, 0,3 mM de indutor (IPTG) e 3 horas de indução, sendo significativo somente para a fração solúvel da proteína. A proteína foi purificada em coluna de afinidade de níquel. As endotoxinas foram removidas com triton X114, sem perda significativa da proteína durante o processo (380 ?g/mL). A taxa de recuperação foi de 33% e o rendimento final foi de 348 ?g/mL. A proteína foi sequenciada com 99% de similaridade com a subunidade B da toxina diftérica, apresentando-se como antígeno promissor para o desenvolvimento de uma vacina contra a difteria.

Abstract: The aims of this work was to produce a recombinant protein with immunogenic potencial against Corynebacterium diphtheriae, which can be used as a subunit vaccine. The C. diphtheriae was used for cloning the B subunit of the diphtheria toxin gene, as it is the immunogenic portion of the molecule. The PCR product was inserted into the cloning vector pAE and amplified in Escherichia coli DH5alfa. To the protein expression, the plasmid containing the insert was trasnfected into E. coli BL21 pLysS. The best culture conditions were 31ºC, IPTG 0.3 mM e 3 hours of induction, being significant only to the soluble fraction. The protein was purified by nickel affinity column and endotoxins were removed with Triton X-114, with no significant protein loss (380 ?g/mL). The recovery rate was 33% with the final yield of 348 ?g/mL. The protein was sequenced and showed 99% of similarity to the diphtheria toxin B subunit. The heterologous protein, here produced, is a promising antigen for a vaccine production against the diphtheria disease.