Construção de vetores de expressão eucariótica da proteína AlF1 (apoptosis-inducing factor 1 ) e seus mutantes de cisteína : ferramentas para investigar os papéis redox do AIF1

Abstract

Resumo : Inicialmente descoberto pela função de indução à apoptose, o apoptosis-inducing factor (AIF) é uma proteína monomérica que se encontra fixada na membrana interna da mitocôndria. O AIF faz parte da classe das flavoproteínas, ou seja dependente do cofator FAD, especificamente para a função de NADH oxidoredutase. AIF, entretanto, é reconhecido como proteína envolvida na indução da apoptose. Quando ocorre o estímulo apoptótico, o AIF é clivado e é liberado para o citosol e posteriormente para o núcleo, onde promove fragmentação de DNA em larga escala, levando assim à morte celular. No entanto, estudos posteriores mostraram a importância do AIF na manutenção fisiológica do complexo I da cadeia transportadora de elétrons. E, além disso, foi mostrado que o AIF é capaz de se ligar à proteína tiorredoxina, através de pontes de dissulfeto, a qual pode estar relacionada com suas funções. Portanto, esse trabalho teve como objetivo principal a construção de vetores de expressão eucariótica do AIF1 humano, assim como mutantes de cada uma das cisteínas, que servirão como ferramentas para estudos das funções redox do AIF. A clonagem do gene AIF1 foi realizada a partir de um plasmídeo contendo o gene da AIF em um vetor comercialmente disponível. Uma etiqueta de hemaglutinina (HA) foi fundida na porção C-terminal, originando a proteína de fusão AIF-HA. A partir dessa construção a técnica de mutação sítio dirigida foi usada para produzir os três mutantes de cisteína para serina (C255S, C316S e C440S), impedindo a formação de pontes de dissulfeto. O sucesso da clonagem e das mutagêneses foram avaliadas através de sequenciamento de DNA e expressão dos vetores em células HEK293T, que confirmaram a integridade da sequência de interesse e a expressão correta do gene. Os resultados de expressão mostraram que o AIF selvagem é expressa em quantidades mais altas do que os AIFs mutados. Em conclusão, este trabalho resultou na produção e na caracterização de ferramentas que servirão para estudos posteriores da importância das cisteínas na função redox do AIF1.