Caracterizacao da proteina GlnK de Streptococcus mutans /

Abstract

Orientadora : Elaine Machado Benelli

Dissertacao (mestrado) - Universidade Federal do Parana, Setor de Ciencias Biologicas, Programa de Pos-Graduacao em Bioquimica. Defesa: Curitiba, 20/02/2006

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Resumo: Streptococcus mutans e uma bacteria gram-positiva que faz parte da florabucal normal e e considerado o principal agente etiologico da carie dentaria. Nesseorganismo, o gene glnK foi identificado, porem sua funcao e desconhecida. O geneglnK codifica para uma proteina da familia PII que participa da regulacao dometabolismo do nitrogenio, carbono e energia em bacterias, eucariotos e arqueas.Para caracterizar a proteina GlnK de S. mutans, o gene glnK foi amplificado a partirdo DNA genomico utilizando oligonucleotideos sintetizados. O fragmento amplificado foi clonado nos vetores pET29b(+) e pET28b(+), originando os plasmideos pMEGP2e pMEGP3, capazes de expressar a proteina GlnK de S. mutans na sua forma nativa(GlnK-Sm) e fusionada | uma cauda N-terminal de histidinas (GlnK-His-Sm),respectivamente. A proteina GlnK-Sm foi purificada por cromatografia de troca anionica (Q-Sepharose) e de afinidade (Hi-Trap Heparin) em um sistema FPLC. A proteina GlnK-His-Sm foi purificada por cromatografia de afinidade na coluna Hi-TrapChelating-Ni2+. A massa molecular aparente e da proteina GlnK-His-Sm foideterminada por experimentos de gel filtracao, sugerindo que em solucao, esta proteina e um homohexamero. Alem disso, a proteina GlnK-His-Sm nao foi uridililadapela proteina GlnD de Escherichia coli. A atividade das proteinas GlnK-Sm e GlnKK His-Sm foi avaliada nas estirpes YMC10 (selvagem), UNF3435 (glnB- glnK-) eNCM1686 (glnD-) de E. coli expressando o operon nifLA de Klebsiella pneumoniae apartir do promotor lac. Em K. pneumoniae, a proteina NifL inibe a atividade da proteina NifA em altas concentracoes de amonio. Sob condicoes de limitacao denitrogenio, a proteina GlnK desfaz o complexo NifL-NifA e restaura a atividade deNifA. A proteína lnK-Sm nao foi capaz de inibir o efeito repressor de NifL sobre a proteina NifA K. pneumoniae. Alem disso, a proteina GlnK-Sm aparentemente bloqueia a acao das proteinas GlnB e GlnK de E. coli sobre o complexo NifL-NifA K.pneumoniae. Por outro lado, a proteina GlnK-His-Sm capaz de restaurar parcialmente a atividade da proteina NifA, sob condicoes limitantes de nitrogenio, demaneira semelhante | proteina GlnK de E. coli.