Sequenciamento e sub-clonagem do gene recX de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo : o gene recA de H. seropedicae, contido em um fragmento de 4,5 kb EcoRI, no plasmídeo pBMR5, hibridizou com o gene recA de E. coli K12. Dois fragmentos, 3,6 kb Hindlll e 0,7 kb EcoRIIHindlll, contidos no fragmento de 4,5 kb EcoRI, foram subclonados separadamente nos vetores pTZ18R e pTZ19R, originando os plasmídeos pBMR503 e pBMR19, respectivamente. O seqüenciamento total do DNA inserto do pBMR19 e o parcial do pBMR503 produziu uma seqüência contínua de bases, que, quando submetida a comparações no banco de dados, revelou homologia com a proteína RecX de diversos organismos. A seqüência do gene recX de H. seropedicae está depositada no Genbank sob o número de acesso AF084045. No intuito de expressar a proteína RecX, foram construídos primers, que, além de conterem bases complementares a região 5' e 3' do gene, apresentavam sítios de restrição adequados para posterior clonagem em vetor de expressão. O plasmídeo pBMR5 foi utilizado como DNA molde na reação de amplificação que originou fragmentos com tamanhos variados. Os fragmentos foram utilizados como DNA-inserto na ligação com o vetor pTZ19R. Após várias análises dos clones resultantes da ligação, dois plasmídeos, pCWG3 e pGWG10, por apresentaram insertos com o tamanho esperado, 0,5kb, foram isolados e serão submetidos ao seqüenciamento. Os resultados obtidos confirmam a presença do gene recX, organizado de forma contígua ao gene recA, e indicam a possível clonagem do gene recX de H. seropedicae no vetor pTZ19R