Expressão e purificação da proteína recombinante 6HIS-ADAM23 e sua utilização como antígeno na produção de anticorpos

Abstract

Resumo : Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, as células nervosas precursoras migram para seus destinos finais e os axônios crescem ao longo de um trajeto preciso e consistente até que encontrem seus alvos, com os quais estabelecem contatos especializados. Ao prosseguir sua navegação em direção ao alvo, axônios defrontam tanto com moléculas adesivas da matriz extracelular como da superfície das células, sendo que estas moléculas podem promover o crescimento axônico. ADAM23 é uma proteína potencial de adesão célula-célula e célula-matriz extracelular e é principalmente expressa no sistema nervoso central. Estes fatos sugerem que ADAM23 pode ter um importante papel na manutenção estrutural e funcional do sistema nervoso. Neste trabalho, a proteína recombinante ADAM23 foi expressa em sistema heterólogo de Escherichia coli com etiqueta de seis histidinas a partir do vetor de expressão pET32 e em seguida purificada, sob condições desnaturantes, por cromatorafia de afinidade a metal imobilizado. A eficiência da purificação foi comprovada por ensaio de Western Blotting, no qual a proteína purificada foi reconhecida por dois diferentes anticorpos: anti-sHis e anti-peptídeo ADAM23. Um coelho da raça neozelandesa foi imunizado com a proteína recombinante. O soro hiperimune (após a quinta e a sétima imunização) foi empregado em ensaios de Western Blotting após a separação do antígeno por SDSPAGE. Os anticorpos policlonais presentes no soro hiperimune foram capazes de reconhecer tanto a proteína recombinante, como ao antígeno expresso no cérebro de camundongos adultos e recém-natos, validando a capacidade dos anticorpos no reconhecimento da proteína ADAM23 endógena.