Clonagem e expressao do gene ginZ de Azospirillum brasilense

Abstract

Resumo : O nitrogênio é um elemento essencial para todos os organismos. As plantas são incapazes de assimilar o nitrogênio atmosférico mas podem metabolizar amônia. Azospirillum brasilense é uma bactéria fixadora de nitrogênio encontrada em associação com a raiz de diversas plantas de interesse agrícola como milho, trigo, sorgo e arroz. O processo da fixação biológica do nitrogênio, caracterizado pela redução do dinitrogênio atmosférico a amônia, é altamente regulado tanto a nível da síntese quanto da atividade do complexo enzimático. Uma das proteínas envolvidas na cascata de regulação da fixação de nitrogênio é a PII ou GlnB, produto do gene glnB. A proteína GlnZ ou PZ, produto do gene glnZ, é uma paráloga de PII; PII e GlnZ possuem alta similaridade (66% identidade e 92% similaridade) porém funções celulares distintas. A fim de caracterizar a proteína PZ, o gene glnZ foi amplificado por peR a partir do DNA genômico de Azospirillum brasilense e oligonucleotídeos sintetizados a partir da seqüência do gene depositada no banco de dados GenBank. O fragmento amplificado foi clonado no vetor de expressão pT7-7, resultando no plasmídeo recombinante pMSA-L 1, e no vetor pTZ19R, originando o plasmídeo recombinante pMSA-2. O inserto presente nos dois vetores foi sequenciado e apresentou 100% de identidade com o gene glnZ de A. brasilense depositado no banco de dados. Testes de solubilidade foram realizados com a proteína GlnZ que encontrou-se tanto na fração solúvel quanto na insolúvel do extrato celular das bactérias transformadas com o plasmídeo pMSA-L 1. Após indução com lactose ou IPTG, a proteína GlnZ de A. brasilense foi superexpressa na sua forma nativa em E. coli estirpes BL21 (DE3)pLysS e RB9065(DE3).