Padronização de metodologias para caracterização funcional da H2AZ em Trypanosoma cruzi

Abstract

Resumo : O protozoário flagelado Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, enfermidade que acomete cerca de 8 milhões de pessoas em 21 países. Pertencente à família Trypanosomatidae da ordem Kinetoplastida, o parasita divergiu cedo na escala evolutiva, apresentando peculiaridades com relação a sua biologia molecular eucariótica. Em virtude também de seu complexo ciclo de vida, estudos vêm sendo realizados visando evidenciar processos e moléculas envolvidas na regulação da expressão gênica e encontrar possíveis alvos para o tratamento da doença de Chagas. Visto que a composição da cromatina pode fornecer diversas plataformas favoráveis às moléculas regulatórias, o presente trabalho teve como foco sua integrante H2AZ. Esta histona, variante da canônica H2A, além de ser evolutivamente bastante conservada, apresenta indícios de que pode tanto prevenir o espalhamento da heterocromatina quanto participar da ativação da transcrição gênica. Com o intuito de evidenciar as funções da H2AZ no T. cruzi, foi objetivado realizar construções gênicas que possibilitassem o nocaute condicional e duplo da histona e transfectá-las em T. cruzi, bem como obter a expressão heteróloga da H2A e H2AZ na fração solúvel do extrato bacteriano para ensaios de interação com proteínas endógenas do parasita e detecção de parceiros moleculares. Foram testadas três metodologias para PCR de fusão utilizando primers quiméricos, para obtenção dos produtos intermediários, e os primers 5’ e 3’ das extremidades das construções, para obtenção das mesmas. Para o nocaute condicional foi utilizada a fusão carboxi terminal do domínio desestabilizador FKBP na H2AZ e seus ligantes específicos rapamicina e Shld1. A metodologia mais eficiente consistiu em realizar a PCR com quantidades equivalentes a 1 molécula do produto de marcador de seleção para 5 moléculas dos demais produtos, sem suceder reações de fusão. Tal metodologia foi utilizada para produzir os 7 µg necessários para transfecção das construções gênicas no T. cruzi. As culturas foram repicadas semanalmente e após o período de seleção nenhum parasita foi encontrado em nenhuma das culturas. Este resultado, entretanto, não possibilita afirmar que o nocaute duplo da H2AZ ocorreu e que esta é vital ao parasita, uma vez que os parasitas do nocaute condicional também morreram. Para obtenção da expressão heteróloga das proteínas recombinantes H2A e H2AZ, fusionadas a seis resíduos de histidina e à GST, foram testadas três cepas de Escherichia coli. A expressão na fração solúvel do extrato bacteriano foi obtida apenas para proteínas fusionadas à GST, utilizando a cepa AD494(DE3). As proteínas recombinantes obtidas foram ligadas eficientemente à resina de glutationa, todavia não foi possível eluí-las com 10 mM nem com 20 mM de glutationa reduzida. Tal resultado, no entanto, não é prejudicial à realização dos ensaios de interação, uma vez que os complexos proteicos formados podem ser obtidos no final da purificação por meio de processos físicos. Com esse trabalho, conclui-se que algumas mudanças na estratégia inicial devem ser realizadas - testes com diferentes concentrações de rapamicina e Shld1 e com a fusão amino terminal do domínio desestabilizante - para evidenciar a função da H2AZ em T. cruzi.