Investigação e caracterização de RNA dupla fita em Phyllosticta spinarum e Guignardia citricarpa

Abstract

Resumo : Fungos são organismos que muitas vezes habitam os mais variados tecidos vegetais. Se há sintomas, os fungos são considerados fitopatogênicos. Se não, o fungo é endofítico. Os fungos utilizados neste trabalho foram isolados de plantas cítricas, como endofíticos (espécie Phyllosticta spinarum) ou causando a doença Mancha Preta de Citros (MPC) (espécie Guignardia citricarpa). Constatou-se que alguns isolados das espécies de P. spinarum e G. citricarpa apresentam RNA dupla fita (RNAdf) e os possíveis efeitos destes elementos na virulência ou outras alterações fenotípicas dos seus hospedeiros ainda são desconhecidos. Para entender estes efeitos, é necessária a obtenção de linhagens isogênicas, a mesma linhagem com e sem o RNAdf, pela cura destas partículas virais. Para isto, foram feitos experimentos de cura com linhagens das duas espécies infectadas com RNAdf envolvendo repiques sucessivos de pontas de hifas de colônias em tratamento com ciclohexamida e/ou temperatura moderadamente elevada (37ºC). Constatou-se que as concentrações de ciclohexamida utilizadas que variaram de 100 µg/mL até 0,5 µg/mL inibiram o crescimento total dos fungos das duas espécies, enquanto que o tratamento à 37ºC por duas gerações foi capaz de gerar alterações fenotípicas nas colônias de duas linhagens de P. spinarum, que levaram à formação de setores. Estes foram isolados e, após extração de ácidos nucléicos totais, foi confirmada a eliminação do RNAdf. Linhagens de G. citricarpa também foram submetidas a este tratamento e em uma colônia também houve alterações na morfologia, com a formação de setores. A confirmação da cura desta linhagem ainda está em andamento. Análises de RAPD ("Random Amplified Polymorphic DNA") foram feitas para comprovar a isogenia entre os setores formados (linhagens curadas) em P. spinarum e a linhagem original, com o RNAdf. Com os oligonucleotídeos iniciadores utilizados, não foi possível confirmar a isogenia das linhagens e seus setores curados, pois estas apresentaram padrões de bandas semelhantes, mas não idênticos, conforme o esperado em caso de isogenia. Novas extrações de ácidos nucléicos totais das linhagens originais e das curadas estão sendo feitas para serem utilizados nas próximas investigações do perfil de bandas por RAPD. Considerando que os setores curados tenham realmente uma mesma identidade biológica com a linhagem original, uma possível explicação para o observado é que eles, além de perderem RNAdf, também perderam outros elementos genéticos (mini-cromossomos) levando à um padrão de bandas diferente da linhagem com o RNAdf. Na literatura, estes elementos são descritos como não essenciais para a sobrevivência do fungo e são comuns em fungos fitopatogênicos, pois carregam genes responsáveis pelo processo de colonização das plantas.