Utilização da técnica MSA-PCR para caracterizações de regiões de DNA diferencialmente metilados em pacientes com Rinite Alérgica

Abstract

Resumo : A metilação de ilhas CpG do DNA é uma importante forma de regular a expressão de genes, podendo, inclusive, colaborar com o aparecimento de doenças multifatoriais, como a rinite alérgica. Por se tratar de uma doença complexa (causas genéticas, epigenéticas e ambientais), a rinite alérgica não tem ainda um completo entendimento sobre seu funcionamento e nem formas eficazes de minimizar os efeitos colaterais de seus tratamentos, de maneira que projetos que contribuam para uma melhor compreensão da mesma são necessários. Uma das formas de caracterização do perfil de metilação é através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase realizado com Iniciadores Aleatórios Sensíveis à Metilação (MSAPPCR). Esta técnica permite a diferenciação entre padrões de metilação presentes em controles sadios e em pacientes com rinite alérgica através uma análise global do genoma. Previamente nosso grupo no laboratório de Epigenética da UFPR identificou polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) no lócus IL4-IL13 e dando continuidade ao estudo caso-controle na rinite alérgica foi utilizada a técnica de MSAP-PCR. Para padronização, inicialmente foram utilizadas amostras de DNA obtidas a partir de 20 ml de sangue periférico de oito indivíduos, quatro considerados controles e quatro considerados casos (com rinite). Após a obtenção do DNA através da técnica de fenol/clorofórmio, utilizou-se 0,8 µg de DNA para restrição enzimática com cada uma das enzimas: MspI e HpaII (isoesquizômero de MspI, sensível a metilação). Em seguida foram realizadas PCR para amplificação dos genes MLH1 e P53 para verificar a eficácia da digestão e a integridade do DNA digerido, respectivamente. Após essa etapa, procedeu-se a execução da técnica de MSAP-PCR com o uso do par de primers MGF0/MGF2 e do primer simples MLG2. Para visualização das amplificações foram realizadas corridas eletroforéticas a 200V em géis de poliacrilamida 8% por 4 horas à 4°C. Após padronização das quantidades de enzimas de restrição, tempos e temperaturas de anelamento nas PCRs, concentração de poliacrilamida e tempos de corrida nos géis, foi observada a presença de uma banda de DNA de aproximadamente 350pb, obtida na PCR com o par de primers MGF0/MGF2, metilada em duas das amostras dos DNAs controles (50%) e ausente em 100% das amostras dos DNAs dos pacientes. O fragmento de DNA encontrado na amostra controle foi purificado do gel de agarose e clonado no vetor pGEMTeasy. Os clones recombinantes foram coletados e o fragmento foi sequenciado e identificado como a proteína com os domínios PDZ/LIM. Esta proteína apresenta características de sinalização intracelular, o que poderia influenciar na formação preferencial de linfócitos Th2, promovendo as reações inflamatórias exacerbadas nos pacientes com rinite alérgica analisados.