Isolamento e cultivo primario de células da glia de Hoplias malabaricus para ensaios de neurotoxidade : desenvolvimento de um protocolo.

Abstract

Resumo : Nos últimos anos, tem sido demonstrado que o uso de cultura de células como um modelo in vitro, fornece um sistema experimental adequado para o estudo de mecanismos tóxicos a nível celular e molecular, por permitir um ambiente controlado e isolado dos sistemas fisiológicos múltiplos que regulam suas atividades in vivo. Os peixes são considerados excelentes modelos biológicos, pois fatores como a manutenção em laboratório, cuidados com a limpeza, alimentação, fácil aquisição dos exemplares e baixos custos de manutenção, favorecem a utilização deste grupo em trabalhos de toxicologia. Neste sentido, a cultura de células de peixes torna-se uma ferramenta promissora para o estudo da toxicidade. No entanto, não existem dados relacionados ao uso de cultivo primário de células nervosas da traíra (Hoplias malabaricus), e tão pouco estudos de efeitos e de mecanismos de toxicidade relativas aos contaminantes de origem antrópica. Neste trabalho, glias e neurônios provenientes do encéfalo de traíra, uma espécie nativa, foram isoladas através de dissociações mecânica e enzimática, separadas por centrifugação utilizando um gradiente de separação Optiprep, e cultivadas pelo período de até 45 dias. Após o isolamento, estimou-se a viabilidade celular pelo método de exclusão de Tripan e pelo teste de MTT (metabolismo mitocondrial). As células foram cultivadas em meio DMEM-F12 e incubadas à 24ºC sobre placas de 96 poços tratados com Poli-L-Lisina, Matrigel ou Fibronectina, sendo que as células não aderiram quando na ausência das proteínas de matriz. Na tentativa de identificar e caracterizar morfologicamente os tipos celulares obtidos em cultura foram realizados ensaios de imunofluorescência usando anticorpos que reconhecem proteínas específicas de glia e neurônio de camundongo. Entretanto, não foi possível diferenciar as células das culturas primárias. O experimento consistiu em desenvolver uma metodologia de cultivo primário das células da glia de peixe para testes de neurotoxicidade. Os resultados contribuirão para a avaliação da contaminação antes da ocorrência de efeitos críticos nas células nervosas propriamente ditas e o estudo das respostas celulares possibilitará a detecção rápida e sensível de distúrbios ambientais. Palavras-chave: Células Nervosas, Cultivo Primário, Hoplias malabaricus, Toxicologia Celular, Ecotoxicologia