Quantificação de STI1 em amostras biológicas através do método imunoenzimático (ELISA)

Abstract

Resumo : A STI1, stress-inducible protein, é uma proteína conservada entre diferentes espécies e possui expressão elevada em condições de estresse. Ela associa-se a outras proteínas como Hsps 70 e 90 e PrPC promovendo diferentes funções. Esta proteína tem sido encontrada com expressão aumentada em vários tipos de câncer tais como pancreático, hepatocelular, ovariano e glioma. Assim, a quantificação de STI1 pelo método ELISA, uma técnica de sensibilidade, especificidade, precisão, de simples execução, baixo custo e rapidez, torna-se uma importante ferramenta para o estudo da STI1 em tumores. Neste trabalho foram testados dois tipos de ELISA: o indireto e o de competição de antígeno. No ELISA indireto a padronização das diluições do anticorpo primário (anti-STI1) e secundário (anti-IgG coelho) foi de 1:2000. O extrato total de encéfalo de camundongo após a sua preparação foi testado como possível fonte de antígeno STI1 na sua forma nativa. Esta amostra foi preparada através de uma centrifugação, então congelou-se o sobrenadante e depois do seu descongelamento foi utilizado nos experimentos. A faixa linear de detecção foi em µg/ml, de: 3,9; 2; 1 e 0,5. Problemas com a precipitação do antígeno STI1 recombinante foram parcialmente resolvidos a partir do armazenamento da solução antígeno em glicerol 20%. A amostra de MEM com e sem soro fetal bovino acrescida de STI1 recombinante (rec.) também foi testada, porém a absorbância de 1200 ng/ml de STI1 rec. nos dois tipos de MEM comparada a curva padrão foi menor. Dessa maneira optou-se em realizar o ELISA de competição de antígeno. Para o mesmo, na placa Nunc MaxiSorp, a determinação da quantidade de IgG de coelho anti-STI1 foi de 2,5 µg/ml, a diluição da extravidina-HRP foi de 1:2000 e a concentração de OPD foi de 0,8 mg/ml. A curva padrão de STI1 recombinante e STI1 recombinante biotinilada, com limite de saturação estabelecido em 150 ng/ml, foi parcialmente semelhante a curva descrita para a detecção de cGMP por ensaio imunoenzimático (manual), sendo necessário maior número de ensaios para obter uma curva melhor e verificar a reprodutibilidade. Mesmo assim a amostra de sobrenadante de extrato total de encéfalo de camundongo, a mesma do ELISA indireto, foi testada, e não resultou em uma curva igual a curva padrão, logarítmica, mas conforme a quantidade de amostra e consequentemente de STI1 aumentava a absorbância diminuía, o que era esperado para o ELISA de competição de antígeno. Assim também é necessário realizar mais ensaios para obter uma curva dessa amostra semelhante a curva padrão. A amostra MEM sem soro fetal bovino também foi testada no ELISA de competição de antígeno. A detecção de STI1 nessa amostra foi mais baixa quando comparada com a curva padrão. Porém quando foi adicionada 1200 ng/ml de STI1 biotinilada a 50% MEM sem soro fetal bovino e 50% PBS-BSA 0,1%, e 25% MEM sem soro fetal bovino e 75% PBS-BSA 0,1%, e estas condições comparadas a PBS-BSA 0,1% com 1200 ng/ml de STI1 biotinilada, as absorbâncias foram semelhantes. Dessa maneira a amostra MEM sem soro fetal bovino pode ser diluída para detectar STI1, contudo mais ensaios deverão ser realizados para comprovar a evidência.