Caracterização do RNA dupla fita em Guignardia citricarpa e validação do protocolo de cura
Resumo
Resumo : O fungo Guignardia citricarpa é um fitopatógeno de extrema importância para a citricultura brasileira, por ser o agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC). Recentemente, foi relatada a infecção por vírus de RNA dupla-fita (RNAdf) em diferentes linhagens dessa espécie. Algumas dessas linhagens foram submetidas à cura deste RNAdf por meio de repiques sucessivos de ponta de hifa, após incubação por 21 dias com temperatura moderamente elevada para este gênero (37ºC), a fim de evidenciar a influência deste elemento nestes fungos. Com este tratamento foram obtidas colônias aparentemente curadas. Este trabalho teve como objetivos obter isolados de G. citricarpa de plantas cítricas da região de Paranavaí-PR; identificar ao nível de espécie os isolados obtidos; detectar RNAdf nestes novos isolados; curar isolados de seu RNAdf; avaliar a eficácia da técnica de repiques sucessivos de ponta de hifa associada à temperatura moderamente elevada (37ºC) para a cura de RNAdf do fungo G. citricarpa e avaliar metodologias para detectar linhagens compatíveis de G. citricarpa, para identificar possível transferência horizontal do RNAdf. Após três etapas de isolamento de citros foi obtido um isolado de Guignardia e vários fungos de outros gêneros. Este isolado foi identificado como G. citricarpa por meio de características morfológicas macroscópicas e microscópicas e também por teste do halo em meio aveia. Também foi feita uma PCR ("Polymerase Chain Reaction") do tipo "multiplex", com primers espécie-específicos para G. citricarpa e G. mangiferae com resultado positivo de amplificação para G. citricarpa. Este isolado foi submetido a uma purificação de ácidos nucléicos e após a eletroforese, uma banda semelhante à descrita anteriormente de RNAdf foi visualizada. No entanto, seis meses depois, uma nova purificação foi realizada e a banda extra não foi mais observada na eletroforese. Acredita-se que o não aparecimento dessa banda é resultado de uma baixa titulação de moléculas de RNAdf. O processo de cura deste isolado ainda está em andamento. As colônias curadas, obtidas anteriormente por outros autores, foram submetidas a novas extrações de ácidos nucléicos totais para avaliar a eficácia do protocolo utilizado. Em algumas linhagens consideradas curadas, foi possível observar novamente uma banda extra, com tamanho semelhante à banda anteriormente identificada como de RNAdf. Nestes casos, ao invés da cura completa, deve ter ocorrido uma diminuição na titulação das moléculas de RNAdf durante o tratamento que não foi detectada na eletroforese. Com o tempo, ocorreu um aumento significativo no número destas partículas virais, o que tornou novamente possível a visualização da banda de RNAdf. Estes resultados mostram que a eletroforese em gel de agarose 1% para detectar a presença de RNAdf pode não ser um método eficiente, sendo necessário a utilização de outras técnicas mais precisas. O teste de compatibilidade vegetativa foi feito pelo crescimento pareado em placa de Petri, deixando a distância de 2 ou 1 centímetros entre os inóculos que sempre foram de uma linhagem com RNAdf e outra sem. Em todos os ensaios foi possível identificar o encontro das hifas, porém não foram observadas anastomoses entre as hifas.
Collections
- Bacharelado [1169]