Avaliação de mecanismos pós-trancricionais na regulação da expressão heteróloga em tripanossomas

Abstract

Resumo: A genomica funcional e um campo em ascensao, o que se deve em parte ao numero crescente de sequencias de genomas publicados, o que tende a aumentar com o advento de novas plataformas de sequenciamento. Para elucidar a funcao genica em tripanossomas, ha um conjunto de tecnicas e metodologias que podem ser empregadas. Uma delas e a expressao heterologa utilizando promotores regulados por repressor de tetraciclina. No entanto, alguns relatos demonstraram que ha uma certa fraqueza no controle da expressao de genes toxicos na ausencia do indutor, e este fato pode limitar os avancos de diversas abordagens pos genomica. Alem disso, estes sistemas requerem previa modificacao de celulas, que e trabalhoso e pode resultar em mudancas fisiologicas, tais como a patogenicidade dos microorganismos. Partindo desta premissa, nos projetamos dois vetores de expressao em tripanossomas, um para Trypanosoma brucei, que regula a expressao genica no nivel transcricional pelo promotor GPEET com operadores de tetraciclina (Tet) e pos-transcricionalmente por moleculas de riboswitches, ribozimas sensiveis a tetraciclina. O segundo grupo de plasmideos foi projetado para regular a expressao genica em Trypanosoma cruzi apenas pos-transcricionalmente por moleculas de riboswitches. As construcoes foram criadas usando pLEW 100 e pRock como vetores parentais para T. cruzi e T. brucei, respectivamente. Os niveis de regulacao por riboswitch inativado por tetraciclina atingiu cerca de 3 a 4 vezes no aumento da expressao do gene reporter RLUC, utilizando Tet a 1 ƒÊg/mL. Por outro lado, o riboswitch ativado por Tet provocou reducao cerca de 2 vezes na expressao do gene reporter nas mesmas condicoes. Alem disso, nossos dados demonstraram uma possivel influencia negativa sobre niveis de expressao genica em T. cruzi quando doses elevadas de tetraciclina (10 ƒÊg/mL) foram testadas. Nossas tentativas iniciais mostraram que riboswitches sao funcionais nestes organismos e podem ser usados para regular a expressao genica em tripanossomas. No entanto, este sistema deve ser melhorado para obter maiores niveis de regulacao. Sugerimos que mudancas no numero e/ou na posicao dos riboswitches podem contribuir para incrementar a regulacao neste sistema.