Caracterização morfológica, molecular e fisiológica de isolados clínicos e ambientais de Acanthamoeba

Abstract

Resumo: As amebas do gênero Acanthamoeba são denominadas anfizóicas por sua capacidade de viver tanto na forma de vida livre quanto como parasitas de vertebrados, causando infecções graves como a Encefalite Amebiana Granulomatosa e a ceratite amebiana em humanos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar amostras clínicas e ambientais de Acanthamoeba obtidas na cidade de Vitória-ES, por análise morfológica, molecular e fisiológica. Para os estudos foram utilizadas quatro amostras clínicas obtidas de raspado de córnea de pacientes com ceratite amebiana (AR, ALX, LG, e WAL) e quatro amostras ambientais isoladas do ambiente doméstico de um destes pacientes (AR11 AR12, AR14 e AR15). Os isolamentos foram realizados em meio ágar soja contendo bactérias (Escherichia coli) e as culturas foram posteriormente submetidas à axenização em meio proteose-extrato de levedo - peptona (PYG) suplementado com 10% de soro bovino fetal. Duas amostras ambientais de ambiente hospitalar (OPH e ICU) e duas cepas de Acanthamoeba do American Type Culture Collection (ATCC), uma caracterizada como patogênica (AP2-ATCC 30461) e outra como não patogênica (AP4-ATCC 30872), foram incluídas para comparação. A confirmação do gênero Acanthamoeba foi realizada por análise da morfologia e tamanho dos cistos e por PCR para amplificação de uma região conservada do gene 18S rDNA. A identificação genotípica foi realizada pelo agrupamento dos isolados nos genótipos determinados por Stothard et al (1998), por meio do sequenciamento da região ASA.S1 do gene 18S rDNA. Ensaios fisiológicos de termotolerância (28 ºC, 37 ºC e 42 ºC) e de osmotolerância (0,1 M, 0,5 M, e 1,0 M de manitol) foram utilizados para avaliar a patogenicidade dos isolados, sendo aplicados nas culturas em ágar soja e adaptados para culturas axênicas. Os isolados foram confirmados como pertencentes ao gênero Acanthamoeba, sendo que nove apresentaram características morfológicas do grupo II e um do grupo I de Pussard e Pons (1977). O sequenciamento parcial do gene 18S rDNA revelou uma frequência de 100% do genótipo T4 nos isolados clínicos (AR, ALX, LG, WAL e AP2). Dos isolados ambientais sequenciadas três foram do genótipo T4 (AR11, AR14 e AP4) e dois do genótipo T11 (AR15 e OPH). Nos ensaios de termotolerância, nos dois sistemas de cultivo, os isolados clínicos e ambientais cresceram até 37 ºC, ou seja, em temperatura que lhe permitiriam sobreviver no organismo humano. Os testes de osmotolerância indicaram crescimento até a concentração de 0,5 M de manitol para a maioria dos isolados em meio ágar soja, porém não houve correspondência com os dados obtidos em cultivo axênico, em que maioria não cresceu nesta osmolaridade. Apenas um isolado (ALX) manteve-se viável em meio ágar soja contendo 1,0 M de manitol, condição que tem sido usada por outros autores como discriminante de patogenicidade, e somente os isolados AP2 e AP4 resistiram a esta osmolaridade em cultivo axênico. Os resultados obtidos neste trabalho confirmaram a predominância do grupo morfológico II e do genótipo T4 de isolados de Acanthamoeba, conforme tem sido registrado na literatura e indicaram que os testes de termotolerância e osmotolerância podem não ser adequados para avaliar o potencial patogênico do protozoário.