Desenvolvimento de um scFv adaptado para triagem/diagnóstico da doença renal crônica

Abstract

Resumo: O acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs) está associado a diversasdoenças, devido à má filtração renal, em especial com a progressão da Doença RenalCrônica (DRC). A dosagem desses analitos em soro de pacientes desperta grande interessepara fins diagnósticos e terapêuticos. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi a utilizaçãodo fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo para a concepção de umbiossensor, que possa ser empregado em um teste de diagnóstico e favorecer a detecçãode AGEs em pacientes com DRC. Para tanto, soro albumina humana (HSA) foi modificadopara obtenção de carboximetillisina, a molécula CML, formando HSA-CML, que é um AGEamplamente estudado. O anticorpo monoclonal mAb2D6G2 serviu como protótipo naconstrução do scFv. O gene sintético codificante para o scFv foi clonado em vetor deexpressão para produção da molécula recombinante em sistema heterólogo. Acaracterização funcional do fragmento de anticorpo foi realizada por imunoensaios comoWestern Blotting e ELISA. A eficiência de glicação, de HSA-CML, foi demonstrada por meioda mobilidade eletroforética e confirmada por análise de espectrometria de massa. O scFvreagiu de maneira dose-dependente frente a HSA-CML evidenciado por ELISA, e manteveo mesmo perfil de reconhecimento à molécula-alvo quando comparado ao anticorpomonoclonal de origem. Nos experimentos de ELISA de competição o scFv foi eficiente emdetectar diferentes concentrações de HSA-CML presente nas amostras de soro humanocontaminado artificialmente. Um estudo mais detalhado desse scFv permitirá seu empregocomo biossensor para analisar soros de pacientes com DRC.

Abstract: The accumulation of advanced glycation end products (AGEs) is associated with variousdiseases due to impaired renal filtration, particularly with the progression of Chronic KidneyDisease (CKD). Measuring these analytes in patient serum has garnerated significantinterest for both diagnostic and therapeutic purposes. In this context, the objective of thisstudy was to utilize the single-chain variable fragment (scFv) of an antibody to develop abiosensor that could be employed in diagnostic tests, facilitating the detection of AGEs inCKD patients. To this end, human serum albumin (HSA) was modified to obtaincarboxymethyllysine (CML), forming HSA-CML, a well-studied AGE. The monoclonalantibody mAb2D6G2 was used as a prototype for devoloping the scFv. The synthetic genecoding for the scFv was cloned into an expression vector for the production of therecombinant molecule in a heterologous system. The functional characterization of theantibody fragment was performed using immunoassays including Western Blotting andELISA. The efficiency of HSA glycation to form HSA-CML was demonstrated throughelectrophoretic mobility and confirmed by mass spectrometry analysis. The scFv showeddose-dependent reactivity to HSA-CML, as evidenced by ELISA, and maintained the samerecognition profile for the target molecule when compared to the original monoclonalantibody. In competition ELISA experiments, the scFv successfully detected differentconcentrations of HSA-CML in artificially contaminated human serum samples. A moredetailed study of this scFv will allow its application as a biosensor to analyze serum samplesfrom CKD patients.