A toxicidade dos derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos MI-J e MI-D em células HEPG2 está relacionada aos seus efeitos sobre a bioenergética mitocondrial

Abstract

Resumo: O carcinoma hepatocelular (CHC) é considerado um dos mais incidentes e representa a segunda causa de morte por câncer no mundo. Uma vez que poucas terapias são eficazes para esse tipo de câncer, é essencial a busca por novas opções de tratamento. Neste contexto, os derivados mesoiônicos 1,3,4-tiadiazóis são promissores por apresentarem atividade citotóxica e antitumoral contra diferentes linhagens de células tumorais. Neste estudo foram avaliados os efeitos dos derivados 1,3,4-tiadiazóis MI-J e MI-D em células de hepatocarcinoma humano (HepG2), cultivadas em dois meios de cultura, um com alta concentração de glucose (MEIO AG), para direcionar o metabolismo para a via glicolítica e, outro sem glucose e com glutamina e galactose (MEIO GAL), para favorecer a fosforilação oxidativa. Em meio AG, no tempo de 24h, pelo método do MTT a viabilidade foi reduzida em ~23% por ambos derivados na concentração de 25 µM. Pelo método do cristal violeta nessas mesmas condições, a redução foi mais pronunciada (~47%) aumentando a redução nos outros tempos avaliados (48h e 72h). Na maior concentração (50 µM), a redução foi de ~90% para ambos compostos nos dois métodos. Essa citotoxicidade, na concentração de 50 µM, foi confirmada pelo aumento da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH), no meio de cultura, em ~90% após 24h de incubação. Em meio GAL, neste mesmo tempo de incubação, observou-se uma redução na viabilidade pelo método do MTT de ~57% para o MI-J e de ~20% para o MI-D, na menor concentração (5 µM), chegando a ~67% de redução para ambos os compostos na concentração de 50 µM. Pelo método do cristal violeta, na concentração de 5 µM, a citotoxicidade foi de ~19%, aumentando para ~49% na concentração intermediária (25 µM), com perfil semelhante para ambos os compostos em 24h. A enzima LDH apresentou maior atividade no tempo de 72h, com ~41% de aumento para o MI-J e ~36% para o MI-D, na concentração de 50 µM. Ensaios de respiração celular evidenciaram que o fluxo de oxigênio nas células HepG2 foi alterado com o aumento da concentração dos derivados, sendo estes efeitos mais pronunciados no meio GAL. Foi observada a diminuição nos níveis de ATP (~38%) na concentração de 25 µM do MI-J em meio GAL, enquanto que, em meio AG a redução observada para esse composto foi menos pronunciada (~27%). Nessa mesma concentração, o MI-D reduziu os níveis de ATP apenas em meio GAL (~15%). Em meio AG, ambos os compostos promoveram um aumento de ~32% nos níveis de lactato na concentração de 25 µM. Nessa concentração em meio GAL, os níveis de lactato aumentaram cerca de ~46% com o MI-J e ~35% com o MI-D. No mesmo meio, os níveis de piruvato diminuíram em ~15% após a exposição ao MI-J e ~ 9% com o MI-D. Em conjunto, estes resultados confirmam a toxicidade dos derivados MI-J e MI-D para as células HepG2. Também sugerem que o comprometimento de funções mitocondriais está relacionado à toxicidade dos derivados nestas células, uma vez que foram mais pronunciados em meio contendo galactose e glutamina.

Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is considered the most prevalent liver cancer and represents the second cause of cancer death worldwide. Since few therapies are effective for this type of cancer, the research for new treatments is essential. In this context, mesoionic derivatives from 1,3,4-thiadiazolium class are promising due to their cytotoxic and antitumor activities against different tumor cells. This study evaluated the effects of 1,3,4-thiadiazoles derivatives MI-J and MI-D on human hepatocarcinoma cells (HepG2). Two culture media were used, the first one containing glucose at high concentration (AG medium), with the aim of directing the metabolism to glycolic pathway and the other not containing glucose and supplemented with glutamine and galactose (GAL medium), to favoring the oxidative phosphorylation. In AG medium, MTT method showed a reduction of ~ 23%, for both derivatives, MI-J and MI-D (25 M). At the same conditions, crystal violet method also evidenced a reduction in the cells viability; however, it was more pronounced (at ~ 47%, 48h and 72h of incubation). At the highest concentration (50 µM), the derivatives reduced the viability around 90%, as showed by MTT and crystal violet methods. This cytotoxicity was confirmed by the increased activity of Lactate Dehydrogenase (LDH) for both culture media (~ 90%, 24h of incubation). In the GAL medium, the viability was reduced at ~ 57% and ~ 20%, for MI-J and MI-D (5 µM), respectively, as observed by MTT method, after 24h of incubation. This reduction reached to ~ 67% for both compounds at the concentration of 50 µM. When the method was crystal violet staining, the cytotoxicity of both derivatives was similar (~19%) at the lowest concentration (5 µM), increasing to ~ 49% at the intermediate concentration (25 µM). The LDH activity was increased after 72 h of incubation with the derivatives, by around 41% and 36%, for MI-J and MI-D (50 µM), respectively. The assays of cellular respiration in AG medium showed that the derivatives promoted a decrease in oxygen flux of HepG2 cells, in a concentration dependent way. The cellular respiration was changed by both derivatives in a concentration dependent way, being this effect more pronounced in GAL medium. ATP levels decreased (~38%) in response to incubation with MI-J (25 µM) after 24h of incubation in the GAL medium. In AG medium, this reduction was less pronounced (~27%). MID (25 µM) reduced the ATP levels only in GAL medium (~15%). In AG medium, both derivatives (25 µM) promoted an increase of ~ 32% in lactate levels, while in GAL medium the metabolite was increased about ~ 46% and 35% for MI-J and MI-D, respectively. In the same medium, pyruvate levels decreased at ~ 15% and 9% after 24h of exposure to MI-J and MI-D, respectively. Taken together, these results reinforce the toxicity of MI-J and MI-D on HepG2. The results also suggest that the impairment of mitochondrial functions is related to the toxicity of the derivatives in HepG2 cells, since their effects were more pronounced when these cells were cultured in medium supplemented with galactose and glutamine in the absence of glucose.