Desenvolvimento e validação de método analítico cromatográfico para determinação de alfa e beta ácidos presentes no lúpulo

Abstract

Resumo: O cone de lúpulo é de alto interesse industrial por seus óleos essenciais easresinasmacias. A quantificação de alfa e beta ácidos presentes nas resinas é essencial para produção e controle de qualidade da cerveja. Neste estudo avaliou-se diferentes modos de preparo, redução da quantidade de amostra e o desenvolvimento de uma metodologia alternativa por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) emrelação a oficial fornecida pela EBC (European Brewery Convention). Na metodologia proposta, a fase móvel foi constituída por água deionizada acidificada com ácido acético a 1% e metanol na proporção 10:90 (v/v), com vazãode1ml/min,temperatura da coluna de 40 °C, detecção UV à 314 nm, injeção a 20µl ecoluna C18. O padrão analítico utilizado foi o extrato internacional de calibração (ICE-4), preparado conforme recomendações da EBC. A avaliação da diminuição da quantidade de amostra de 10 para 5 g e de 50% no volume dos solventes de extração foi feita para diminuir custos de análise e passivos ambientais. O preparo das amostras de lúpulo da variedade Comet foi realizado em triplicata, utilizando almofariz, moedor elétrico e nitrogênio líquido. Para a extração dos analito sutilizou-se 20 ml de metanol, 100 ml de éter etílico e 40 ml de ácido clorídrico0,1 M sob agitação em shaker a 20°C por 40 min e repouso na geladeira por 10 min para coletar 2,5 ml do sobrenadante, para depois depositar em um balão de 25ml e preencher com metanol. Em seguida, a solução foi filtrada e transferida em um vial para injeção. Para avaliação da influência da redução da amostra de lúpulo e dos solventes foi repetido o procedimento descrito, utilizando 50% da amostra e dissolventes. A metodologia desenvolvida foi submetida à validação, por meio dos parâmetros de seletividade, linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, precisão e exatidão. Os cromatogramas apresentaram picos com boas resoluções e os dados da quantificação foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e Teste de Tukey com 1 e 5% de significância. As quantificações de alfa e beta ácidos na análise de influência de redução de massa e dos solventes apresentaram para 5g, valores de 11,88% e 4,00%, e para 10 g, 11,69% e 3,98% respectivamente. Para os diferentes preparos de amostra empregando almofariz, moedor e nitrogênio líquido, apresentaram 12,59% e 3,97%; 11,61% e 3,64%; 11,88% e 3,79% de alfa e beta ácidos, respectivamente. Conforme a análise estatística não houve variação significativa entre os métodos de preparo, redução da massa, solventes da amostra. A exatidão foi confirmada nos alfa ácidos pela estatística e os beta ácidos apresentaram uma diferença aceitável devido a probabilidade observada (p=0,004) estar próxima ao limite de 0,01 (1% de significância) e os alfa ácidos serem prioritários na quantificação devido a propiciarem majoritamente (80-85%) o amargor acerveja. Ométodo desenvolvido foi validado e se mostrou confiável, reprodutível e adequado para a quantificação de alfa e beta ácidos, oferecendo vantagens de economia de solventes, tempo analítico e redução de custos em comparação ao método oficial

Abstract: The hop cone is of high industrial interest due to its essential oils and soft resins. The quantification of alfa and ß acids present in the resins is essential for beer production and quality control. This study evaluated different preparation methods, the reduction of sample quantity, and the development of an alternative methodology using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) in relation to the official method provided by the European Brewery Convention (EBC). In the proposed methodology, the mobile phase consisted of deionized water acidified with 1% acetic acid and methanol in a 10:90 (v/v) ratio, with a flow rate of 1 ml/min, a column temperature of 40 °C, UV detection at 314 nm, injection volume of 20 µl, and a C18 column. The analytical standard used was the international calibration extract (ICE-4), prepared according to EBC recommendations. The evaluation of decreasing thesamplequantity from 10 to 5 g and a 50% reduction in the volume of extraction solventswasperformed to reduce analysis costs and environmental liabilities. The preparationof Comet variety hop samples was carried out in triplicate, using a mortar and pestle, anelectric coffee grinder, and liquid nitrogen. For the extraction of analytes, 20 ml of methanol, 100 ml of ethyl ether, and 40 ml of 0.1M hydrochloric acid were used under agitation in a shaker at 20 °C for 40 min, followed by rest in the refrigerator for 10 min to collect 2.5 ml of the supernatant, which was then transferred to a 25 ml flask and filled with methanol. Subsequently, the solution was filtered and transferred to a vial for injection. To evaluate the influence of the reduction of hop sample and solvents, the described procedure was repeated, but with 50% of sample and dissolvents. The developed methodology was subjected to validation, by checking the parameters of selectivity, linearity, limit of detection, limit of quantification, precision and accuracy. The chromatograms presented peaks with good resolution, and the quantification data were subjected to analysis of variance (ANOVA) and Tukey's Test with 1 and 5% significance. The quantifications of alfa and beta acids in the analysis of mass and solvent reduction influence showed values of 11,88% and 4,00% for 5 g, and 11,69% and 3,98% for 10 g, respectively. For the different sample preparations employing mortar and pestle, grinder, and liquid nitrogen, the results were 12.59% and 3.97%; 11.61% and 3.64%; 11,88% and 3,79% for alfa and ß acids, respectively. According to the statistical analysis, there was no significant variation among the preparation methods, mass reduction, and sample solvents. Accuracy was statistically confirmed for alpha acids. Regarding beta acids, the observed difference was deemed acceptable given the obtained p-value (p=0.004) approaches the 0.01 threshold (1% significance level). Furthermore, alpha acids are prioritized in quantification as they are the major contributors (80-85%) to beer bitterness. The developed method was validated and proved to be reliable, reproducible, and suitable for the quantification of alfa and ß acids, offering advantages in solvent economy and analytical time compared to the official method