Caracterização de anticorpos monoclonais anti-toxinas do veneno de Bothrops jararaca

Abstract

Resumo: Por ano, no mundo, mais de 5 milhões de indivíduos sofrem acidentes com serpentes. No Brasil, são notificados cerca de 30 mil casos por ano, sendo o gênero Bothrops sp. responsável por 80% dos acidentes, seguido do gênero Crotalus sp.. O veneno dessas serpentes é composto em sua maioria por metaloproteinases, toxinas responsáveis principalmente pelos distúrbios de coagulação causados no envenenamento. Atualmente, o diagnóstico do ofidismo é realizado através da identificação da serpente e da sintomatologia do paciente, o que frequentemente induz a erros no tratamento, o qual consiste na aplicação de soros heterólogos gêneroespecíficos. Apesar dos antivenenos serem o único tratamento eficaz para os efeitos sistêmicos do envenenamento, eles podem causar reações adversas e apenas 5% dos anticorpos presentes neutralizam efeitos tóxicos do veneno. No Brasil, já foram desenvolvidos testes que auxiliam na identificação das espécies causadoras da mordida, contudo a maioria é baseado em uma mistura de anticorpos policlonais, o que impede a reprodutibilidade do ensaio. Pensando nisso, nosso grupo produziu anticorpos monoclonais (mAbs) anti-toxinas do veneno de Bothrops jararaca e esse trabalho visou a caracterização imunoquímica e funcional dos anticorpos, além de desenvolver um diagnóstico diferencial in vitro para o ofidismo causado por serpentes do gênero Bothrops sp. e Crotalus sp.. Dessa forma, foram caracterizados 4 anticorpos por ELISA e Western Blot, os mAbs 1C10E7 e 5C7F9 apresentaram reatividade contra proteínas contidas nos venenos de B. jararaca, B. alternatus e B. neuwiedi. Já o anticorpo 3A7B9 reconheceu componentes presentes nos venenos de todas as espécies de Bothrops sp. testadas e não apresentou reatividade cruzada com veneno de Crotalus durissus terrificus, Lachesis muta e Micrurus frontalis. O anticorpo 1B9F1 apresentou o mesmo perfil do mAb 3A7B9, contudo reconheceu o veneno de C. d. terrificus e L. muta cruzadamente. A fim de identificar os alvos dos anticorpos, foi realizado o mapeamento de epitopos das principais toxinas presentes nos venenos e análise por espectrometria de massas. Os resultados obtidos indicam que os possíveis ligantes para os anticorpos 1C10E7, 1B9F1 e 3A7B9 são metaloproteinases. Ademais, a purificação de uma classe de metaloproteinases por cromatografia de hidrofobicidade e um ELISA frente às frações purificadas corroborou que os possíveis alvos dos mAbs 1C10E7, 1B9F1 e 3A7B9 são metaloproteinases do tipo P-II ou P-III. Foi avaliada a capacidade dos anticorpos em inibir os efeitos deletérios dos venenos, e não foi observada proteção dos mAbs 1C10E7 e 3A7B9 frente às atividades fibrinogenolítica e caseinolítica das metaloproteinases. Além disso, foi possível obter as sequências aminoacídicas completas das regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos 3A7B9 e 1C10E7. Por fim, foi desenvolvido um teste diagnóstico diferencial in vitro para acidentes causados por Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus utilizando a mistura dos anticorpos 1C10E7 e 3A7B9 o qual apresentou um limite de detecção de toxinas de 60 ng.mL-1 em soros contaminados artificialmente com diferentes venenos. Esses resultados reforçam a importância da produção e emprego dos anticorpos monoclonais no estudo e detecção das toxinas ofídicas. Palavras-chave: Bothrops jararaca; envenenamento; anticorpos monoclonais; diagnóstico; metaloproteinases

Abstract: Every year, more than 5 million people are bitten by snakes around the world. In Brazil, around 30 thousand cases are reported and the genus Bothrops sp. is responsible for 80% of the accidents, followed by the genus Crotalus sp. The venom of these snakes is mostly composed of metalloproteases, toxins mainly responsible for the coagulation disorders in the envenomation. Currently, the diagnosis of snakebite is made through the identification of the snake and the patient’s symptoms which often leads to errors in treatment as it consists in the application of heterelogous genumspecific serums. Although antivenoms are the only effective treatment for the systemic effects of envenomation, they may cause adverse reactions and only 5% of the present antibodies neutralize the toxic effects of the venom. In Brazil, tests have already been developed to identify the species that cause biting, however the majority are based on a mixture of polyclonal antibodies, which inhibits reproducibility. Considering this, our group produced monoclonal antibodies (mAbs) against toxins of Bothrops jararaca venom and this work aimed at the immunochemical and functional characterization of the antibodies, in addition to developing an in vitro differential diagnosis for snakebite caused by snakes of the genus Bothrops sp. and Crotalus sp.. Thus, 4 antibodies were characterized by ELISA and Western Blot, mAbs 1C10E7 and 5C7F9 showed reactivity against proteins present in the venoms of B. jararaca, B. alternatus and B. neuwiedi. The 3A7B9 antibody recognized proteins in the venoms of all species of Bothrops sp. tested and showed no cross-reactivity with Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta venom. The 1B9F1 antibody presented the same profile as the 3A7B9 mAb, however cross-reacted with the C. d. terrificus and L. muta venom. In order to identify the antigen of the antibodies, a SPOT assay and mass spectrometry were used and the tests suggested that the possible targets of antibodies 1C10E7, 1B9F1 and 3A7B9 are metalloproteinases from snake venom. Furthermore, the purification of a class of metalloproteinases by hydrophobic chromatography and an ELISA against the purified fractions corroborated that the possible targets of mAbs 1C10E7, 1B9F1 and 3A7B9 are type P-II or P-III metalloproteinases. Moreover, the neutralization capacity of antibodies 1C10E7 and 3A7B9 against the fibrinogenolytic and caseinolytic activity of metalloproteinases was not observed through activity assays. Besides that, it was possible to obtain the complete amino acid sequences of the variable domains of the heavy and light chains of the 3A7B9 and 1C10E7 antibodies. Finally, an in vitro differential diagnostic test was developed for accidents caused by Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus using a mixture of antibodies 1C10E7 and 3A7B9, which presented a toxin detection limit of 60 ng.mL-1 in serum artificially contaminated with different venoms. The results presented so far reinforce the importance of the production and use of monoclonal antibodies in the study and detection of snake toxins