Avaliação in vitro de atividades biológicas de fosfolipases-D em células endoteliais

Abstract

Resumo: O gênero de aranhas Loxosceles é cosmopolita, sendo encontrado em todos os continentes e inclui espécies que representam riscos à saúde no Brasil, como L. intermedia, L. laeta e L. gaucho. Essas aranhas são peçonhentas e a inoculação de seu veneno é responsável por desencadear o quadro clínico denominado loxoscelismo. Essa condição pode se apresentar em quadros clínicos que incluem manifestações cutâneas como dermonecrose e sintomas sistêmicos como falência renal e distúrbios hematológicos, tais como hemólise intravascular e anemia hemolítica, podendo ser fatal. Esses efeitos são causados por toxinas presentes no veneno, como as fosfolipases-D (PLD). Uma isoforma de PLD do veneno de L. intermedia é o foco deste estudo, pois sozinha produz a maioria dos sintomas do envenenamento. Embora existam estudos sobre PLDs, ainda há lacunas no entendimento de sua ação. Neste projeto, uma isoforma recombinante de PLD do veneno de L. intermedia foi testada em células endoteliais humanas (EA.hy926), de forma a considerar o endotélio da derme um dos primeiros e principais tecidos a entrar em contato com as toxinas. Para isso, foram realizados processos de expressão e purificação da PLD recombinante, cultivo celular, ensaio de morfologia, imunofluorescência, ensaios de viabilidade (MTT e Vermelho Neutro) e de proliferação celular. A morfologia das células não se mostrou afetada após a exposição com a toxina, de forma que os tratamentos ao longo do tempo, até 24 horas, eram comparativamente iguais aos controles negativos. A imunofluorescência com células EA.hy926 mostrou que a PLD se liga à membrana celular já após cinco minutos de exposição, mostrando um perfil de ligação não contínuo e pontual na membrana plasmática e hipoteticamente sendo eliminada da superfície das células por meio de microvesículas extracelulares. Os ensaios de viabilidade MTT e Vermelho Neutro não indicaram alteração da viabilidade celular, após comparar com o controle negativo. Além disso, o ensaio de proliferação também não mostrou diferença ao comparar os resultados da ação da toxina sobre as células com o controle negativo do experimento, indicando que a PLD não altera o perfil proliferativo das células. Novos ensaios de interesse serão realizados no futuro, como o de imunofluorescência com dupla marcação para membrana e PLD, e isolamento de microvesículas para análises dos conteúdos transportados, sendo hipoteticamente a PLD, miRNA e/ou conteúdo lipídico. Além disso, também é de interesse a realização do estudo da expressão gênica e microscopia eletrônica de varredura para a melhor compreensão da mecanística das PLDs sobre a biologia celular de células endoteliais

Abstract: The Loxosceles spider genus is cosmopolitan, found worldwide, and includes species that represent health risks in Brazil, such as L. intermedia, L. laeta, and L. gaucho. These spiders are venomous, and can cause loxoscelism, a condition with clinical manifestations ranging from skin necrosis to systemic effects, like kidney failure and blood disorders, such as hemolytic anemia and intravascular hemolysis which can be fatal. These effects are mainly linked to toxins in the venom, such as phospholipase D (PLD). This study focuses on one recombinant PLD isoform from L. intermedia venom, as it alone triggers most symptoms of envenoming. Despite existing researchs, the mechanisms underlying PLD action upon cells remain poorly understood. This work tested the PLD effect on human endothelial cells (EA.hy926), considering the endothelium as one of the first tissues to interact with the toxin into the dermis. The study included PLD expression and purification, cell culture, morphological analysis, immunofluorescence, viability assays (MTT and Neutral Red), and cell proliferation assay. Results pointed that the cell morphology was not affected after exposure to the toxin, as the treatments over time, up to 24 hours, were comparable to the negative controls. Immunofluorescence revealed that PLD binds to the cell membrane just within five minutes after exposure, forms localized structures like extracellular microvesicles on cell surface and is hypothetically expelled from cells as supramolecular structures. Viability assays (MTT and Neutral Red) revealed no significant changes compared to the negative control. Likewise, the proliferation assay showed no differences on the proliferative profile after PLD exposure compared to control. Future research will include immunofluorescence with different markers, isolation of microvesicles to analyze their contents (potentially PLD, miRNA, and/or lipids), gene expression studies, and scanning electron microscopy to better understand the cytotoxicity mechanisms of PLD