Estudo da infectividade in vitro de Leishmania infantum sob efeito da disrupção do gene para proteína flagelar PF-16 utilizando a técnica de CRISPR/Cas9

Abstract

Resumo: A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada a nível mundial e de notificação compulsória no Brasil. A doença é causada por protozoários do gênero Leishmania, e possui altas taxas de mortalidade e diversas limitações terapêuticas e epidemiológicas. Assim, o desenvolvimento de ferramentas que busquem alternativas vacinais ou para tratamentos com baixos efeitos colaterais faz-se necessário. Sabidamente, o gene PF-16 codifica uma proteína essencial para a formação e funcionalidade do flagelo do parasito, estrutura responsável pela sua motilidade e capacidade de infecção. Diante do exposto, o presente estudo utilizou a tecnologia CRISPR/Cas9, que permite a disrupção específica de genes em Leishmania, visando criar linhagens de parasitos com mobilidade reduzida, diminuindo sua capacidade de infecção. Essa metodologia apresenta grande especificidade no direcionamento da disrupção, devido à presença de um RNA guia (gRNA) sintético complementar aos alvos de interesse. Deste modo, é possível direcionar com precisão a região onde a quebra de dupla fita ocorre. Uma vez realizada a entrega do complexo Cas9+gRNA, é possível individualizar as células editadas e gerar populações clonais com um mesmo genótipo para genes de interesse. Durante a execução dos experimentos, contudo, observou-se uma dificuldade em obter mutantes para o gene PF-16, indicando possíveis limitações metodológicas ou uma essencialidade inesperada do gene em L. infantum. Esse resultado contrasta com o já observado para outras espécies de Leishmania, nas quais disrupções similares foram alcançadas. Experimentos realizados também em L. infantum, todavia com outros genes, demonstraram que a metodologia é eficiente para a disrupção de genes específicos na espécie. Os resultados sugerem que a realização do mesmo procedimento de edição com o desenho de gRNAs em regiões gênicas distintas pode levar a resultados positivos na obtenção de parasitos mutantes para PF-16

Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a globally neglected disease and a notifiable condition in Brazil. The disease is caused by protozoa of the Leishmania genus and is characterized by high mortality rates, as well as therapeutic and epidemiological limitations. Thus, the development of tools aimed at vaccine alternatives or treatments with minimal side effects is essential. It is known that the PF-16 gene encodes a protein essential for the formation and functionality of the parasite’s flagellum, a structure responsible for its motility and infective capacity. In this context, the present study utilized CRISPR/Cas9 technology, which enables targeted gene disruption in Leishmania, to create parasite strains with reduced mobility, thereby diminishing their infectivity. This methodology is highly specific in directing disruption due to the presence of a synthetic guide RNA (gRNA) complementary to the target sequences of interest. This allows precise targeting of the region where double-strand breaks will occur. Once the Cas9+gRNA complex is delivered, it is possible to isolate edited cells and generate clonal populations with the same genotype for genes of interest. However, during the experiments, difficulties were observed in obtaining mutants for the PF-16 gene, suggesting potential methodological limitations or an unexpected essentiality of the gene in L. infantum. This result contrasts with findings in other Leishmania species, where similar disruptions were achieved. Nonetheless, experiments conducted in L. infantum with other genes demonstrated that the methodology is efficient for specific gene disruptions in this species. The results suggest that performing the same editing procedure with gRNA designs targeting distinct gene regions may yield positive outcomes in obtaining PF-16 mutant parasites