Construção e analise fisiologica de plasmideos recombinantes capazes de expressar gene nifA de Azospirillum brasiliense

Abstract

Resumo: O fragmento Sall/Sall de 2,5 Kb foi isolado do plasmídeo plO (pSUP202::m/A de Azospirillum brasilense) e inserido no sítio de poli clonagem do pTZ18R em ambas orientações, resultando nos plasmídeos pMLl-A e pMLl-B. Deletando-se o fragmento de 0,34 Kb Sall/Smal do pMLl-A, foi retirado uma provável região promotora do nif A, produzindo então o pML2. Posteriormente, esses três plasmídeos foram transferidos para mutantes ntrC de Escherichia coli que continham uma fusão nifH::lacZ de Klebsiella pneumoniae. Nesses experimentos a proteína NifA de A. brasilense foi incapaz de ativar a expressão do promotor nifH, mesmo na ausência de oxigênio e na presença de íons Fe+^. Contudo, o produto do gene nif A deK. pneumoniae expresso constitutivamente (pCK3) ativou a transcrição do promotor independente da presença de amônia ou de oxigênio. A NifA de K. pneumoniae expressa constitutivamente pelo plasmídeo pCK3 foi capaz de restaurar o fenótipo Nif+ dos mutantes FP9 e FP10 de A. brasilense, em condições de fixação de nitrogênio e em presença de amônia. O produto do gene nif A de A. brasilense, expresso sob o controle de um promotor lac constitutivo, não foi capaz de ativar a transcrição da fusão nifH::lacZ do FP10 na presença de amônia sugerindo que a atividade desta proteína NifA, contrariamente 'aquela de K. pneumoniae, é sensível a amônia

Abstract: The 2,5 Kb Sall/Sall fragment containing the nifA gene of Azospirillum brasilense from plO (pSUP202::m/A) was subcloned into the multiple cloning site of pTZ18R in both orientations, producing pMLl-A and pMLl-B. The 0,34 Kb SaU/Smal fragment, containing the putative nifA promoter , was deleted from pMLl-A giving pML2. Plasmids pMLl-A, pMLl-B and pML2 were transferred to Escherichia coli ntrC mutants containing a lacZ fusion in the nifH gene of Klebsiella pneumoniae. These plasmids were unable to activate the expression of P-galactosidase from the K. pneumoniae nifH promoter, in the absence of oxygen or in the presence of different concentrations of Fe. However, when expressed constitutively the NifA protein of K. pneumoniae was able to activate the nifH promoter transcription in the presence or absence of ammonia or oxygen. The NifA protein from K. pneumoniae as theA. brasilense were able to restore the Nif+ phenotype of the A. brasilense mutant (FP10) under nitrogen fixation conditons. However, in the presence of ammonia, only transconjugants carrying the nifA gene from K. pneumoniae expressed constitutively showed the active nitrogenase. The product of the nifA gene from A. brasilense , constitutively expressed from the lac promoter, was unable to activate the transcription of the nijH::lacZ fusion in the presence of ammonia This suggests that the activity of NifA from A. brasilense, contrary to that of K. pneumoniae , is sensitive to NH4+