Analise da atividade das enzimas peroxidases e Beta-1, 3-glucanases em variedades de soja (Glycine max) resistentes e suscetiveis ao fitopatogeno diaporthe phaseolorum

Abstract

Resumo: Duas variedades isogênicas de soja {Glycine max), EMGOPA-301 e EMGOPA-314 (resistência ao cancro da haste incorporada), foram inoculadas com Diaporthe phaseolorum (2x106 conídios/mL) e analisadas quanto à atividade das enzimas peroxidase e (3-1,3-glucanase. Hipocótilos inoculados ou tratados com água destilada estéril foram homogeneizados em tampão de extração e centrifugados. Os sobrenadantes foram utilizados para a determinação das atividades enzimáticas, da concentração de proteínas e para o estabelecimento do padrão isoenzimático por eletroforese nativa em gel de poliacrilamida (PAGE). A atividade de peroxidase foi monitorada pela formação de tetraguaiacol a partir da utilização do guaiacol como substrato. A atividade de (3-1,3-glucanase foi determinada pelo acompanhamento da hidrólise da laminarina, usada como substrato. Para obtenção de atividades enzimáticas em condições adequadas, temperatura, pH e concentrações ótimas de substratos foram determinados para ambas as enzimas. A atividade de (3-1,3-glucanase aumentou com o tempo após a inoculação, para as duas variedades testadas. Este aumento foi observado tanto no material inoculado como nos controles. As duas linhagens da variedade EMGOPA apresentaram aumentos na atividade de peroxidase quando comparadas com os controles não inoculados. Ambas as amostras, EMGOPA-301 e 314, apresentaram respostas similares na atividade total de peroxidases, 120 horas após a inoculação. A atividade de isoenzimas peroxidásicas, determinada por PAGE-nativa resultou em padrões diferentes. A variedade resistente 314 mostrou bandas de atividade que não foram detectadas na variedade 301. Além disso, estas bandas apresentaram intensidades diferentes entre as amostras inoculadas com D. phaseolorum e os controles não inoculados. A utilização dessas enzimas como marcadores bioquímicos de resistência é discutida

Abstract: Two soybean (Glycine max) isogenic varieties EMGOPA-301 and EMGOPA-314 (incorporated resistance to stem canker) were inoculated with Diaporthe phaseolorum (2x106 conidia/mL) and analyzed for peroxidase and (3-1,3-glucanase activities. Inoculated and uninoculated control hypocotyls were homogenized in extraction buffer and centrifuged. The supematant Solutions were utilized to determine enzyme activities, protein concentration and isozymes profiles by native polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE). Peroxidase activity was determined by monitoring tetraguaiacol formation using guaiacol as substrate. Onthe other hand, laminarin was used as a substrate for (3-1,3-glucanase. The activity was expressed in terms of glucose released after hydrolysis by the enzyme. Temperature, pH and substrate concentrations for maximal enzyme activities were determined. Both EMGOPA-301 and 314 varieties showed increases in (3-1,3-glucanase activity. These increases were also noticed in the uninoculated Controls. Both EMGOPA lines showed similar response in the total peroxidase activity for up to 1 2 0 h after inoculation. The peroxidase isoenzyme activities as determined by the use of native PAGE showed different pattems. The EMGOPA-314 variety showed different bands that can not be seen in the EMGOPA-301 variety. In addition, those bands showed different intensities in the sample inoculated with D. phaseolorum from the uninoculated control. The utilization of these enzymes as biochemical markers of resistance is discussed