Análise de vesículas extracelulares mesoteliais (VEMs) como biomarcadores de disfunção peritoneal na doença renal crônica (DRC)

Abstract

Resumo: A doença renal crônica (DRC), caracterizada pela perda lenta e progressiva da função renal de forma irreversível, é um importante e crescente desafio enfrentado pelos sistemas de saúde, e suas taxas de prevalência estão aumentando globalmente. Indivíduos no último estágio da DRC necessitam de terapia de substituição renal, que inclui o transplante renal, hemodiálise ou diálise peritoneal (DP). A DP é uma modalidade de alta qualidade e bom custo benefício, entretanto, a longo prazo, a DP resulta na disfunção da membrana peritoneal, caracterizada por inflamação crônica, fibrose e perda da capacidade dialítica; necessitando a retirada do paciente do programa de DP com transferência para a hemodiálise. Os testes atualmente disponíveis para avaliação da capacidade funcional dialítica da membrana peritoneal só demonstram alterações quando o dano já é muito avançando, assim se fazendo necessário a busca de outras ferramentas para avaliação precoce da disfunção peritoneal. A utilização de vesículas extracelulares (VEs) como biomarcadores têm crescido muito nos últimos anos e diversos trabalhos demonstram o aumento de VEs em diversas doenças, incluindo DRC. Estudos recentes demonstraram que existe uma indução na formação de VEs derivadas da membrana peritoneal em pacientes em DP, além de uma diferença no perfil proteico dessas vesículas em pacientes que iniciaram a DP recentemente ou há mais de um ano. Desta forma as VEs poderiam ser utilizadas como biomarcadores precoce de dano peritoneal. A vantagem na utilização de VEs se dá por serem obtidas por um método indolor e pela possível detecção de um dano peritoneal muito mais cedo do que pelo teste de equilíbrio peritoneal. Assim, o presente estudo isolou, quantificou e caracterizou morfologicamente VEs nos pacientes com DRC em DP. Foram recrutados 5 pacientes após lerem e assinarem o TCLE, sendo todos do sexo masculino com uma média de idade de 68.20±12.91 anos e com tempo em diálise, representado em dias, de 579 (188.5 – 803.5). As comorbidades mais presentes foram Diabetes Mellitus e hipertensão, ambas em 60% dos participantes. As VEs foram isoladas através de centrifugação diferencial e a média de concentração de proteínas foi de 0,76 ± 0,18 mg/mL. Análises de eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida indicam que o tamanho médio das proteínas é de 55 kDa e que as proteínas se mantiveram integras, não sofrendo degradação pelo método de isolamento ou armazenamento. Para análise de diâmetro e padrão de distribuição, foi realizado ensaio de DLS, com resultados mostrando que as VEs possuem diâmetro médio de 160 ?? 30 nm. O tamanho e concentração das MPs foi determinado através de ensaios de NTA. Os resultados indicam um tamanho médio de 155,8 ± 26,27 nm, com concentrações variando em cada paciente. Em conclusão, o presente trabalho foi capaz de identificar, isolar e quantificar VEs no dialisato de pacientes com DRC e que fazem o uso da DP como terapia renal substutiva. Mais, foi capaz de quantificar as proteinas presentes nas VEs e armazenálas sem sua degradação. Estudos nessa área podem auxiliar no descobrimento de novos biomardores de dano e disfunção peritoneal, dessa forma sendo possível o tratamento precoce dessas alterações e permitindo que o paciente possa permanecer na DP, um tratamento essencial que possui diversas vantagens para o paciente em relação a sua contraparte, a HD.

Abstract: Chronic kidney disease (CKD), characterized by the slow and progressive loss of kidney function in an irreversible way, is an important and growing challenge faced by health systems, and its prevalence rates are increasing globally. Individuals with end-stage CKD require renal replacement therapy, which includes kidney transplantation, hemodialysis, or peritoneal dialysis (PD). PD is a high-quality and costeffective modality, however, in the long term, PD results in peritoneal membrane dysfunction, characterized by chronic inflammation, fibrosis, and loss of dialysis capacity; requiring the removal of the patient from the PD program with transfer to hemodialysis. The tests that are currently available to assess the functional capacity of dialysis of the peritoneal membrane only show changes when the damage is already very advanced, thus making it necessary to search for other tools for early assessment of peritoneal dysfunction. The use of extracellular vesicles (EVs) as biomarkers has grown a lot in recent years and several studies demonstrate the increase of EVs in several diseases, including CKD. Recent studies have shown that there is induction in the formation of VEs derived from the peritoneal membrane in PD patients, in addition to a difference in the protein profile of these vesicles in patients who started PD recently or more than one year. In this way, EVs could be used as early biomarkers of peritoneal damage. The advantage of using EVs is that they are obtained by a painless method and by the possible detection of peritoneal damage much earlier than by the conventional tests. Thus, the present study isolated, quantified, and morphologically characterized EVs in patients with CKD on PD. Five patients were recruited after reading and signing the informed consent form, all male with a mean age of 68.20±12.91 years and time on dialysis, represented in days, of 579 (188.5 – 803.5). The most common comorbidities were Diabetes Mellitus and hypertension, both in 60% of the participants. EVs were isolated by differential centrifugation and the mean protein concentration was 0.76 ± 0.18 mg/mL. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analyzes indicate that the average size of the proteins is 55 kDa and that the proteins remained intact, not undergoing degradation by the isolation or storage method. a DLS test was performed for the analysis of diameter and distribution pattern, with results showing that the VEs have a mean diameter of 160 ± 30 nm. The size and concentration of the VEs were determined through NTA assays. The results indicate an average size of 155.8 ± 26.27 nm, with concentrations varying in each patient. In conclusion, the present work identified isolated and quantified EVs in the dialysate of patients with CKD and who use PD as renal replacement therapy. Furthermore, it was able to quantify the proteins present in the EVs and store them without their degradation. Studies in this area can assist in the discovery of new biomarkers of peritoneal damage and dysfunction, thus enabling early treatment of these changes and allowing the patient to remain in PD, an essential treatment that has several advantages for the patient over its counterpart, the HD.