Investigação da interação entre o fator de iniciação da tradução EIF4E1, a proteína 4E-IP1 e o fator EIF3 de Trypanosoma cruzi

Abstract

Resumo: Os protozoários da família Trypanosomatidae, geralmente denominados tripanossomatídeos, possuem mecanismos moleculares peculiares, dentre os quais se destaca o controle da expressão gênica em nível pós-transcricional. Particularmente na iniciação da tradução, que tem sido estudada nas últimas décadas nestes organismos, muitas questões permanecem abertas. Nesta etapa, fatores eucarióticos de iniciação (eIFs do inglês eukaryotic initiation factors) atuam de forma coordenada para montar o ribossomo 80S funcional para tradução do RNA mensageiro (mRNA). Um passo crítico é o reconhecimento da estrutura 5'-cap do mRNA pelo complexo eIF4F através do fator de iniciação eIF4E. Os componentes do complexo eIF4F apresentam uma notável diversidade de homólogos em tripanossomatídeos: seis para EIF4E, cinco para EIF4G e dois para EIF4A. Essa variedade, provavelmente envolvida no controle do ciclo celular do parasita, permite distintas rotas de tradução, canônicas e nãocanônicas, ainda pouco compreendidas. As diferentes afinidades dos homólogos de eIF4E pelo 5'-cap e suas especificidades pelas homólogas eIF4G, ou outras proteínas parceiras, contribui para tal complexidade. A EIF4E1, em especial, diferencia-se por não interagir com EIF4G e, portanto, não formar um complexo eIF4F-like. Em Leishmania major, foi demonstrada sua interação específica com a proteína 4E-IP (EIF4E-Interacting Protein), e embora esta interação tenha sido sugerida como repressora da tradução também em Trypanosoma brucei, os resultados permanecem inconclusivos. Além disso, esta interação nunca foi investigada em Trypanosoma cruzi. Adicionalmente, a subunidade 'a' do fator EIF3 (EIF3a) foi proposta como uma possível parceira de EIF4E1 em L. major. Diante dessas lacunas, este trabalho teve como objetivo investigar a interação entre EIF4E1 de T. cruzi e as potenciais parceiras 4E-IP e EIF3a, visando contribuir para o entendimento da função de EIF4E1 no controle da tradução, especialmente em T. cruzi, espécie menos estudada comparada a T. brucei e Leishmania sp.. Para investigar estas interações, construções das proteínas de interesse foram expressas de forma recombinante em E. coli e purificadas por diferentes técnicas cromatográficas. Ensaios de interação, por meio de cromatografia de exclusão por tamanho analítica, permitiram determinar as condições ótimas para a formação dos complexos EIF4E1/4E-IP e EIF4E1/EIF3a. Estes resultados também indicaram uma relação de competição entre 4E-IP e EIF3a pela ligação a EIF4E1. A caracterização biofísica por fluorimetria de varredura nano diferencial, demonstrou que 4E-IP confere um ganho de estabilidade térmica à EIF4E1, efeito não observado com a ligação de EIF3a. Esta diferença é consistente com a afinidade de ligação mais alta entre EIF4E1 e 4E-IP em relação a EIF3a. A análise de ligação a análogos de cap, tanto por ensaios de termoforese em microescala, quanto por ensaios de afinidade à resina com m7GTP imobilizado, revelaram que, ao contrário do proposto na literatura, a 4E-IP aumenta a afinidade da EIF4E1 pela estrutura 5'- cap. Estes dados fornecem o primeiro mapa de interações entre EIF4E1, 4EIP e EIF3a em T. cruzi e propõem um novo modelo para a função regulatória de EIF4E1 na presença destas proteínas

Abstract: The protozoa of the Trypanosomatidae family, commonly referred to as trypanosomatids, possess unique molecular mechanisms, among which the control of gene expression at the post-transcriptional level stands out. One particularly studied process in recent decades in these organisms is translation initiation, although many questions remain open. During this stage, eukaryotic initiation factors (eIFs) act in a coordinated manner to assemble a functional 80S ribosome for mRNA (messenger RNA) translation. A critical step is the recognition of the 5'-cap structure of the mRNA by the eIF4F complex through the initiation factor eIF4E. The components of the eIF4F complex show a remarkable diversity of homologs in trypanosomatids: six for eIF4E, five for eIF4G and two for eIF4A. This variety, likely involved in the parasite’s cell cycle regulation, allows for distinct, canonical and non-canonical translation pathways that are still poorly understood. The different affinities of eIF4E homologs for the 5'-cap and their specificities for eIF4G homologs, or other partner proteins, contribute to this complexity. EIF4E1 stands out for not interacting with EIF4G and, therefore, not forming an eIF4F-like complex. In Leishmania major, it has been shown to interact specifically with the protein 4E-IP (EIF4E-Interacting Protein), and although this interaction has been suggested to act as a translation repressor in Trypanosoma brucei, the results remain inconclusive. Furthermore, this interaction has never been investigated in Trypanosoma cruzi. Additionally, the ‘a’ subunit of the EIF3 factor (EIF3a) has been proposed as a potential partner of EIF4E1 in L. major, but no direct assay has been performed. Given these knowledge gaps, this study aimed to investigate the interaction between T. cruzi EIF4E1 and its potential partners 4E-IP and EIF3a, with the goal of contributing to the understanding of EIF4E1’s role in translation regulation, particularly in T. cruzi, the least studied species compared to T. brucei and Leishmania spp. To investigate these interactions, constructs of the proteins of interest were recombinantly expressed in E. coli and purified using a combination chromatographic techniques. Interaction assays, performed via analytical sizeexclusion chromatography, enabled the identification of optimal conditions for the formation the EIF4E1/4E-IP and EIF4E1/EIF3a complexes. The results also indicated a competitive relationship between 4E-IP and EIF3a for binding to EIF4E1. Biophysical characterization using nano-differential scanning fluorimetry showed that 4E-IP enhances the thermal stability of EIF4E1, an effect not observed upon binding of EIF3a. This difference is consistent with the comparatively higher binding affinity of EIF4E1 for 4E-IP over EIF3a. Binding assays to cap analogs, using both microscale thermophoresis and affinity chromatography with immobilized m7GTP resin, demonstrated that, contrary to previous reports, 4E-IP increases EIF4E1’s affinity for the 5'-cap structure. Altogether, these findings provide an interaction map of EIF4E1, 4E-IP, and EIF3a in T. cruzi, and support a model for the regulatory role of EIF4E1 in the presence of these interacting partners