Sequenciamento do gene nifB de Herbaspirillum seropedicae e caracterixação da sua região promotora

Abstract

Resumo: Herbaspirillum seropedicae é um diazotrofo endofítico encontrado em associação com várias gramíneas. O gene nifB de H. seropedicae foi sequenciado e a proteína NifB deduzida da seqüência de nucleotídeos apresentou uma identidade de 62 % com a de Bradyihizobium japonicum , 57% com a de R. capsulatus e 47% com a de Klebsiella pneumoniae. A região promotora apresenta sítios de ligação para a proteína NifA e para a RNA polimerase-RpoN (oN). Para se determinar o envolvimento das proteínas NifA e RpoN na ativação do promotor nifB de H. seropedicae, uma fusão plasmidial nifB::lacZ (pEMS140) foi construída e a expressão do promotor do gene nifB de H. seropedicae analisada nas estirpes TH1 (rpoN") e ET8894 (rpoN^) de Escherichia coli e nas estirpes SmRl (selvagem) e SmR54 (nifA') de H. seropedicae. Uma fusão cromossomal nifBr.lacZ foi construída originando a estirpe de H. seropedicae SmR2126. Posteriormente, o gene nif A desta estirpe foi inativado por inserção do gene de resistência à canamicina originando a estirpe Smr2126/1 (inifBr.lacZ, nifAvKm). Em E. coli, o promotor nifB foi ativo apenas na presença das proteínas NifA (expressa constitutivamente pelo pMC71 A) e RpoN de K. pneumoniae. Em H. seropedicae, o gene nifB foi expresso apenas baixas tensões de oxigênio e ausência de íons amônio nas estirpes SmRl contendo o plasmídeo pEMS140 (selvagem) e SmR2126 (nifBr.lacZ). Juntos estes resultados indicam que o a expressão do gene nifB de H. seropedicae requer as proteínas NifA e RpoN. Ensaios de retardamento em gel mostraram que tanto a proteína NifA quanto a RpoN de K. pneumoniae foram capazes de se ligar a região promotora do gene nifB de H. seropedicae