Caracterização bioquimica do sistema enzimatico sacarolÍtico e ureolÍtico da levedura astaxantinogênica Phaffia rhodozyma (xanthophyllomyces dendrorhous)

Abstract

Resumo: Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) é uma levedura basidiomiceta produtora de astaxantina (diceto-diidroxi-p-caroteno). As enzimas invertase e urease dessa levedura apresentam-se intimamente ligadas às células. 0 melhor tempo de cultivo (24 horas) e o melhor método para a extração (ultrasonicação) dessas enzimas foi determinado. Avaliou-se, ainda, a utilização da combinação de diferentes metodologias seqüenciais para a extração das enzimas (e. g., sonicação e abrasão). Tanto a invertase quanto a urease estão presentes nas células da levedura sob a forma constitutiva. A invertase não apresentou repressão catabólita por glucose e a presença de EDTA, na concentração 0,2 mM, inibiu a proliferação das células da levedura. A utilização de celobiose, como única fonte de carbono, levou à produção de uma atividade sacarolítica superior, comparativamente, à obtida com a mesma concentração da própria sacarose. Em contraste com a limitação fisiológica do crescimento celular em temperaturas superiores a 27°C, as enzimas extraídas apresentaram "in vitro" temperaturas ótimas iguais ou superiores a 50°C. A presença de DTT (ditiotreitol), a uma concentração de 2 mM, provocou um acréscimo na atividade da invertase e da urease (nesta mais pronunciadamente). O pH ótimo de catálise determinado para a invertase e para a urease foi 4,5 e 8,0, respectivamente. O pl do complexo invertase está distribuído em uma faixa que abrange de 1,5 a 3,5. O experimento de cromatografia de afinidade, em Concanavalina A, mostrou que a invertase é, possivelmente, uma glicoproteína manosilada e diferentes experimentos demonstraram a presença de isoformas desta e da urease. Os íons metálicos Zn2+ e Hg2+ atuaram como inibidores de ambas as hidrolases, sendo o segundo íon um inibidor mais potente da atividade ureolítica. A anilina e a tiouréia também causaram inibição da atividade sacarolítica e ureolítica, respectivamente. A cromatografia em Concanavalina A-Sepharose permitiu a separação entre as duas famílias de hidrolases e, seguida de cromatografia de troca iônica, sustentam uma metodologia promissora para a purificação da invertase a da urease de Phaffia rhodozyma demonstraram a presença de isoformas desta e da urease. Os íons metálicos Zn2+ e Hg2+ atuaram como inibidores de ambas as hidrolases, sendo o segundo íon um inibidor mais potente da atividade ureolítica. A anilina e a tiouréia também causaram inibição da atividade sacarolítica e ureolítica, respectivamente. A cromatografia em Concanavalina A-Sepharose permitiu a separação entre as duas famílias de hidrolases e, seguida de cromatografia de troca iônica, sustentam uma metodologia promissora para a purificação da invertase a da urease de Phaffia rhodozyma.