Seqüenciamento e análise estrutural e funcional da regiao a montante do gene modE de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo: O gene modE codifica para um potencial repressor de transcrição dos genes m odABC, envolvidos com o transporte de molibdênio. E m Herbaspirillum seropedicae o gene modE foi identificado a cerca de 1,8kb a montante do gene nifA por Voigt (2000). Este gene foi seqüenciado e caracterizado estruturalmente. Neste trabalho o gene m odE, contido no plasmídeo pELV2B, foi mutagenizado por inserção do transposon Tn5B20 originando o plasmídeo pARS8. Este plasmídeo foi transferido para H. seropedicae e mutantes cromossômicos foram obtidos por simples recombinação. Estes mutantes apresentaram atividade de nitrogenase semelhante à da estirpe controle H. seropedicae SmRI, indicando que não houve comprometimento no processo de fixação de nitrogênio. O plasmídeo pELV2B continha também, a montante do gene modE, parte de uma O R F denominada orf4 e que foi subclonada no plasmídeo pELV22B (VOIGT,2000). Neste trabalho foi concluído o sequenciamento do DNA-inserto do plasmídeo pELV22B e a seqüência inicial da oií4 que era de 449 nucleotídeos aumentou para 687 nucleotídeos. Esta seqüência parcial somada a uma seqüência contendo 498 nucleotídeos, situada em outro fragmento a montante, produziu uma seqüência completa que foi identificada como o gene luxA, através de comparações com seqüências de aminoácidos do banco de dados. O gene luxA codifica para a subunidade a da luciferase, enzima que catalisa reações de emissão de luz e m bactérias luminescentes. O gene luxA de H. seropedicae possui 1032 nucleotídeos e foi localizado a montante do gene modE e a aproximadamente 1,2 kb a montante do gene nifA. Ele é transcrito na mesma direção do gene modE e e m direção oposta ao gene nifA. O seu provável códon de término de tradução está sobreposto ao códon de início de tradução do gene modE. A seqüência de aminoácidos deduzida da proteína LuxA apresenta um possível domínio bacjuciferase. Para analisar a presença de uma possível região promotora para os genes modE e/ou luxA foram realizadas fusões no vetor de fusão-/acZ sem promotor pMP220. Foram clonados os fragmentos correspondentes a uma região de 585 nucleotídeos (Pst\/EcoR\) e a uma região de 1266 nucleotídeos (PsW EcoRV) ambas a montante ao gene modE. Esta última contendo 978 dos 1032 nucleotídeos do gene luxA mais 258 nucleotídeos a montante a este gene. Os fragmentos foram clonados e ensaiados para a atividade de (3-galactosidase. Os resultados foram negativos indicando, provavelmente, a ausência de promotor nestas regiões