Identificação de peptideos ligantes a superfície de epimastigotas de Trypanosoma cruzi

Abstract

Resumo: A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma doença potencialmente fatal causada pelo parasito protozoário Trypanosoma cruzi, que é transmitida por insetos da família Reduviidae. Uma vez que o tratamento convencional com drogas nitro-heterocíclicas mostra reações adversas graves e eficiência questionável, diferentes grupos testaram abordagens baseadas em polipeptídeos para interferir com o ciclo celular parasito em outros Tripanosomatídeos. Por exemplo, os nanobodies contra VSG de T. brucei estão sendo expressos em bactérias simbiontes com o objetivo de bloquear a transmissão do parasito, ou usado para melhorar a entrega do fármaco, combinando-os com nanopartículas ou peptídeos líticos. Essas estratégias são apoiadas pelo fato de que os componentes de superfície são candidatos para desenvolver ligantes de superfície para prejudicar a função, pois podem atuar como fatores de virulência. Neste trabalho, usamos uma abordagem de phage display para identificar derivados de peptídeos de duas bibliotecas de peptídeos, LX15 (15 aa) e LX8CX8 (17 aa) (onde X corresponde a qualquer aminoácido). Depois de testar diferentes condições de biopanning usando epimastigotas vivos ou fixados, nós sequenciamos 10 clones que codificam o mesmo polipeptídeo, aqui chamado EPI18. O bacteriófago que codifica EPI18 liga-se a epimastigotes de cepas distintas. Para confirmar estes resultados, este polipeptídeo foi sintetizado e biotinilado para realizar ELISA, citometria de fluxo e análises de microscopia confocal. Nossos ensaios mostram a especificidade e capacidade de ligação para a superfície de epimastigotes em comparação com o peptídeo não relacionado. Também isolamos bacteriófagos de uma biblioteca de peptídeos de bacteriófagos estruturalmente semelhantes (LX15), através do sequenciamento de 30 clones, identificamos 13 sequências diferentes e 4 motivos conservados, sendo que um desses motivos identificados comparte similaridade com o péptido EPI18. Vários peptídeos identificados (EPI18 e de LX15) apresentaram semelhanças com proteínas lipocalinas, que podem ter relevância na biologia da interação, contudo isto deve ser testado. Esses resultados sugerem que os peptídeos identificados aqui possam ter potenciais aplicações biotecnológicas, como estratégias baseadas em peptídeos para controlar a transmissão do parasito.

Abstract: Chagas disease, also known as American trypanosomiasis, is a potentially lifethreatening illness caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, which is transmitted by insects from Reduviidae family. Since the conventional treatment with nitroheterocyclic drugs shows serious adverse reactions and questionable efficiency, different group have tested polypeptide-based approaches to interfere with parasite cell cycle in other Trypanosomatids. For example, nanobodies against T. brucei VSGs are being expressed in endosymbiont bacteria aiming to block parasite transmission or used to improve drug delivery by combining them to nanoparticles or lytic peptides. These strategies are supported by the fact that surface players are candidates to develop surface ligand to impair their function since they may act as virulence factors. In this work, we used a phage display approach to identify peptides derivate of two peptide libraries, LX15 (15 aa) and LX8CX8 (17 aa) (where X corresponds to any amino acid). After testing different biopanning conditions using live or fixed epimastigotes, we sequenced 10 clones encoding the same polypeptide, named here as EPI18. The bacteriophage encoding EPI18 binds to epimastigotes from distinct strains. To confirm these results this polypeptide was synthetized and biotinylated to perform flow cytometry and confocal microscopy analyses. Our preliminary assays show its specificity and binding capacity towards to epimastigotes surface compared to unrelated peptide. We also isolated bacteriophages from a similar phage display peptide library (LX15), through sequencing of 30 clones, we identified, 13 different sequences and 4 conserved motifs, one of these identified motifs shares similarity with of EPI18 peptide. Lipocalins proteins were identified in bioinformatics analysis as corresponding sequences of 6 of our identified peptides, however its relevance needs to be addressed. These results suggest that the peptides identified here may have potential biotechnological applications such as peptide-based strategies to control parasite transmission.