Atividade anticoagulante in vitro e ex vivo da goma guar parcialmente hidrolisada, carboxilada e quimicamente sulfatada

Abstract

Resumo: A heparina é um polissacarídeo naturalmente sulfatado e rico em ácidos urônicos, muito utilizado por promover ação anticoagulante e antitrombótica. Apesar da sua importância, esta apresenta algumas desvantagens como o seu alto custo, efeitos colaterais e risco de contaminação. Estudos de anticoagulantes alternativos baseados em polissacarídeos têm sido desenvolvidos. Muitas destas moléculas são isoladas de plantas, fungos, algas e animais. A goma guar é um polissacarídeo de planta, do tipo galactomanana não carboxilada, que quando hidrolisada e sulfatada apresenta atividade anticoagulante. No entanto, não se conhece o efeito de ácidos urônicos, que podem ser obtidos pela oxidação da goma guar, sobre a sua atividade. Portanto, este trabalho buscou avaliar se a presença de ácidos urônicos na goma guar parcialmente hidrolisada e quimicamente sulfatada contribuiria na ação anticoagulante. Dessa maneira, a goma guar nativa (GG) passou pelo processo de hidrólise ácida parcial, dando origem a GGH (Mw = 1.47 x 104g/mol). Análises de metilação e HSQC confirmaram a estrutura de galactomanana. GGH foi oxidada em um sistema tampão pH 10 utilizando o oxidante 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (TEMPO) e o co-oxidante ácido tricloroisocianúrico (TCCA), gerando frações com baixo grau de oxidação (GGHOP) e com alto grau de oxidação (GGHOT). Todas as frações foram quimicamente sulfatadas e os derivados avaliados para atividade anticoagulante utilizando ensaios de aPTT, PT e TT. As frações oxidadas e sulfatadas mostraram que a atividade anticoagulante foi inversamente proporcional ao grau de oxidação. No entanto, o derivado sulfatado não oxidado GGHS1 mostrou melhor atividade anticoagulante do que a enoxaparina, uma heparina de baixo peso molecular. Todas as frações apresentaram modo de ação semelhante, inibindo principalmente o FIIa, especialmente na presença de antitrombina. Além disso, foram capazes de responder ao antídoto protamina ao apresentarem seu efeito anticoagulante revertido. Os resultados indicaram que a presença de ácidos urônicos (após processo de oxidação) na goma guar parcialmente hidrolisada e quimicamente sulfatada diminui sua atividade anticoagulante, comparando como potencial anticoagulante de GGHS1.

Abstract: Heparin is a naturally sulfated polysaccharide rich in uronic acids, widely used to promote anticoagulant and antithrombotic action. Despite its importance, it has some disadvantages such as its high cost, side effects, and risk of contamination. Studies of alternative anticoagulants based on polysaccharides have been developed. Many of these molecules are isolated from plants, fungi, algae, and animals. Guar gum is a plant polysaccharide of the non carboxylated galactomannan type, which when hydrolyzed and sulfated exhibits anticoagulant activity. However, the effect of uronic acids, which can be obtained by oxidation of guar gum, on its activity is not known. Therefore, this work sought to evaluate whether the presence of uronic acids in partially hydrolyzed and chemically sulfated guar gum would contribute to the anticoagulant action. Thus, the native guar gum (GG) underwent a process of partial acid hydrolysis, giving rise to GGH (Mw = 1.47 x 104 g/mol). Methylation and HSQC analyses confirmed the galactomannan structure. GGH was oxidized in a pH 10 buffer system using the oxidant 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (TEMPO) and the co-oxidant trichloroisocyanuric acid (TCCA), generating fractions with low degree of oxidation (GGHOP) and with high degree of oxidation (GGHOT). All fractions were chemically sulfated and the derivatives evaluated for anticoagulant activity using aPTT, PT, and TT assays. The oxidized and sulfated fractions showed that the anticoagulant activity was inversely proportional to the degree of oxidation. However, the unoxidized sulfated derivative GGHS1 showed better anticoagulant activity than enoxaparin, a low molecular weight heparin. All fractions showed similar mode of action, inhibiting mainly FIIa, especially in the presence of antithrombin. Furthermore, they were able to respond to the protamine antidote by having their anticoagulant effect reversed. The results indicated that the presence of uronic acids (after oxidation process) in partially hydrolyzed and chemically sulfated guar gum decreases its anticoagulant activity compared to the anticoagulant potential of GGHS1.