Caracterização das estirpes mutantes de Herbaspirillum seropedicae nos genes Hsero_3507 e Hsero_3508 que codificam para proteínas de sistema de dois-componentes

Abstract

Resumo : Herbaspirillum seropedicae é uma betaproteobacteria, endofítica, capaz de fixar nitrogênio atmosférico, comumente encontrada associada a diversas plantas de interesse comercial como: arroz, milho, sorgo, cana-de-açucar e trigo. Os genes nif de H. seropedicae são os responsáveis pela maquinaria do complexo da nitrogenase que catalisa a conversão de N2 em NH4 +. Os genes nif têm a sua transcrição ativada pela proteína NifA cuja transcrição e ativação está sob controle do sistema Ntr capaz de sensoriar os níveis de íons amônio. Transcriptomas de H. seropedicae em várias condições de crescimento mostraram a expressão de diversas proteínas que parecem pertencer a sistemas de dois-componentes. Neste trabalho estudamos dois genes do sistema de dois-componentes, os genes Hsero_3507 e Hsero_3508 que codificam, respectivamente, para uma proteína de resposta regulatória do sistema de dois-componentes e para uma histidina quinase do sistema de doiscomponentes. As estirpes mutantes nos genes Hsero_3507 e Hsero_3508 foram obtidas por recombinação homóloga, ocorrendo a inserção dos genes interrompidos por transposon, contendo cassete de resistência a canamicina, dentro do genoma. A estirpe mutante 3508Tn apresentou uma deficiência de crescimento em microaerobiose quando comparada a estirpe selvagem SMR1 e também uma alta motilidade tanto em baixo nitrogênio quanto em alto, sugerindo não sensoriar adequadamente os íons de amônio do meio, podendo ter um maior gasto energético. A estirpe mutante 3507Tn apresentou uma deficiência em motilidade, não formando halo de crescimento e nem película em meio semi sólido, o que sugere que o gene Hsero_3507 possa estar relacionado com a regulação das proteínas motoras do flagelo da célula. As proteínas codificadas por esses dois genes foram expressas e purificadas por cromatografia de afinidade. As proteínas tiveram a conformação quaternária determinada, porém não foi possível detectar interação in vitro entre elas nas condições testadas. Palavras chave: Herbaspirillum seropedicae, sistema dois-componentes, fixação biológica de nitrogênio.

Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a nitrogen fixing endophytic betaproteobacteria found associated with many commercially important plants like: rice, corn, sorghum, sugarcane, wheat. Its nif genes are responsible for the machinery of the nitrogenase complex that transforms N2 to NH4+. The nif genes have their transcription activated by NifA protein whose transcription and activation is under control of the Ntr system, able to sensor the ammonium ions levels. Transcriptomes of H. seropedicae under several growth conditions showed the expression of many proteins that could be associated with the two-component system. In this work, we studied two genes of the two-component system, Hsero_3507 and Hsero_3508 that code, respectively, for a two-component response regulator protein and a two-component histidine kinase. The mutant strains for the Hsero_3507 and Hsero_3508 genes were obtained by homologous recombination, occurring, in the genome, the insertion of interrupted genes with a transposon containing a cassette for kanamicin resistance. The mutant strain 3508Tn had a deficiency in microaerobic growth when compared with the wild strain SMR1 and also had enhanced motility in both low and high nitrogen condition, suggesting that it is not being able to properly sensor the ammonium ions in the environment, which could contribute to a greater energetic expenditure. The mutant strain 3507Tn showed a motility deficiency, not being able to produce a motility halo, nor forming pellicle in semi-solid media, which suggest regulation of the cellular flagella motor as function for the Hsero_3507 gene. The proteins coded by these two genes were expressed and purified with affinity chromatography. Both proteins had their quaternary structure determined, but we were not able to detect in vitro interaction between then in the tested conditions. Keyword: Herbaspirillum seropedicae, two-component system, biological nitrogen fixation.