Regulação da expressão dos transportadores de ânions orgânicos 1 e 3 em células endoteliais humanas após exposição às toxinas urêmicas p-cresil sulfato e indoxil sulfato

Abstract

Resumo: As toxinas urêmicas p-cresil sulfato (PCS) e indoxil sulfato (IS) são associadas a disfunção endotelial, induzindo a produção de moléculas infamatórias e o estresse oxidativo. Tais efeitos estão fortemente relacionadas com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCV), tais como a aterosclerose em pacientes com doença renal crônica (DRC). Recentemente, nosso grupo demonstrou que a captação destas toxinas pelo endotélio vascular é mediada por transportadores de ânions orgânicos 1 e 3 (OAT1 e OAT3). O presente estudo avaliou em células endoteliais humanas o efeito das toxinas urêmicas PCS e IS na expressão de OAT1 e OAT3 bem como de seus fatores de transcrição cAMP responsive element binding protein-1 (CREB1), activating transcription factor-1 (ATF1) e hepatocyte nuclear factor-4? (HNF4?). Para tanto, as células endoteliais foram tratadas com PCS e IS nas concentrações normal, urêmica e máxima urêmica por 24 horas. A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTT com as toxinas na presença ou ausência dos inibidores de OATs probenecid (Pb) ou benzilpenicilina potássica (Bp). A concentração proteica de OAT1 e OAT3 foi avaliada por Western blotting. A extração de RNA foi realizada após tratamento por 24 horas com PCS e IS, com ou sem Pb, Bp, o antioxidante vitamina C (Vit C) e o inibidor da atividade da enzima óxido nítrico sintase endotelial N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME). A expressão gênica dos fatores de transcrição foi analisada por RT-PCR e RT-qPCR. A viabilidade celular foi significativamente reduzida nos tratamentos com PCS em todas as concentrações testadas (P<0,0001), enquanto com IS foram significativas apenas nas concentrações urêmica (P<0,001) e máxima urêmica (P<0,0001), sendo restabelecida após tratamento com Pb ou Bp (P<0,001). Observou-se uma maior expressão proteica de OAT1 e OAT3 após tratamento das células com PCS na concentração máxima urêmica (P<0,05) em comparação ao controle (células sem tratamento). As análises de RT-qPCR demonstraram um aumento significativo (P<0,01) na expressão de CREB1 e ATF1 nos tratamentos com PCS e IS em relação ao controle, efeito que foi revertido pelo Pb, Bp, Vit C e L-NAME (P<0,05). Já o HNF4? teve a expressão aumentada significantemente (P<0,05) apenas nos tratamentos com PCS em relação ao controle. Em conclusão, sugerimos que o ambiente urêmico, especificamente as toxinas PCS e IS, é capaz de modular a expressão gênica dos OATs, possivelmente via aumento do estresse oxidativo. Dessa forma, avanços nessa área podem auxiliar a elucidar os mecanismos celulares e moleculares da toxicidade do PCS e IS no endotélio, possibilitando novos estudos para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas a fim de melhorar a sobrevida do paciente. Palavras-chave: Doença Renal Crônica. Toxicidade urêmica. Disfunção endotelial. OATs

Abstract: Uremic toxins, such as p-cresyl sulfate (PCS) and indoxyl sulfate (IS), are associated with endothelial dysfunction, inducing the production of inflammatory molecules and oxidative stress. These effects are strongly related to the development of cardiovascular diseases (CVD), such as atherosclerosis in patients with chronic kidney disease (CKD). Recently, our group demonstrated the uptake of PCS and IS by vascular endothelium is mediated by organic anions transporters 1 and 3 (OAT1 and OAT3). The present study evaluated the effect of PCS and IS on the expression of OAT1, OAT3 and their transcription factors cAMP responsive element binding protein-1 (CREB1), activating transcription factor-1 (ATF1) and hepatocyte nuclear factor-4? (HNF4?). For that, endothelial cells were treated with PCS and IS at normal, uremic and maximum uremic concentrations for 24 hours. Cell viability was assessed by MTT assay with the toxins in the presence or absence of OATs inhibitors, such as probenecid (Pb) and benzylpenicillin potassium (Bp). The protein concentration of OAT1 and OAT3 was evaluated by Western blotting. RNA extraction was performed with PCS and IS treatment for 24 hours, with or without Pb, Bp, the antioxidant vitamin C (Vit C) and the inhibitor of the enzymatic activity nitric oxide synthase, N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME). The gene expression of the transcription factors was analyzed by RT-PCR and RT-qPCR. The cell viability was significantly reduced in PCS treatments at all concentrations tested (P<0.0001), whereas in IS it was significant only in uremic (P<0.001) and maximal uremic (P<0.0001) concentrations, being restored with Pb or Bp (P<0.001). An increased OAT1 and OAT3 protein expression was observed in the cells after treatment with PCS at maximal uremic concentration (P<0.05) compared to control (untreated cells). The RT-qPCR analysis showed a significant increase (P<0.01) in the CREB1 and ATF1 expression in cells treated with PCS and IS compared to the control, which was restored with Pb, Bp, Vit C and L-NAME (P<0.05). HNF4? had significantly increased expression (P<0.05) only in the treatments with PCS compared to the control. In conclusion, we suggest that the uremic environment, specifically the PCS and IS toxins, is able to modulate the gene expression of OATs, possibly increasing oxidative stress. These findings could help to elucidate the endothelium cellular and molecular of PCS and IS toxicity, enabling further studies for the development of therapeutic interventions in order to improve patient survival. Keywords: Chronic Kidney Disease. Uremic toxicity. Endothelial dysfunction. OATs..