Purificação e propriedades da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de Anas sp (pato)

Abstract

Resumo: A gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.12) de musculo de Anas sp (pato) foi purificada pelo método de Cori et a l (15), com algumas modificações. A enzima foi demonstrada ser pura por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença e ausência de SDS e por eletroforese de zona em fitas de poliacetato de celulose. O peso molecular foi estimado em 140.000 para a enzima nativa e 36.000 para os monômeros. O pH ótimo encontrado foi de 8,2. Os valores de Km foram determinados para o gliceraldeido-3-fosfato e para o NAD sendo em torno de 240 yM e 80 yM, respectivamente. Foi demonstrado que o NADH é um inibidor competitivo em relação ao NAD, sendo o Ki de 17 yM. A adição de metais [2.10-3M] como Mg++ , Mn++ e Ca++ não alteraram significativamente a atividade de GPDH, enquanto Hg++, Cu++ e Zn++ inibiram totalmente a enzima. A titulação de grupos-SH com Nbs2 indicou 12,7 grupos-SH por mol de enzima mas apenas 4 são essencialmente reativos por tetrâmero de enzima. Dos reagentes sulfidrilas testados, o p-hidroxi-mercuribenzoato e o p-cloromercuribenzoato demonstraram ser potentes inibidores, mas a inibição foi totalmente revertida com a adição subsequente de excesso de 2-mercaptoetanol. A validade dos dados cinéticos foi analisada através de programas em linguagem BASIC.