Investigação da interação in vitro entre as proteínas PII, GInZ e GInB, com uma digualanito ciclase (AZOBR_140132) e uma fosfodiesterase (AZOBR_P1130052) de Azospirillum brasiliense Sp245

Abstract

Resumo : A família das proteínas PII é presente em bactérias, arqueias e plantas, possuindo a capacidade de modular a atividade de outras proteínas por interações do tipo proteína-proteína. Dessa forma, elas coordenam processos celulares relacionados, principalmente, ao metabolismo de nitrogênio. A ligação de uma PII aos efetores ATP, ADP e 2-oxoglutarato (2-OG) altera sua conformação e, consequentemente, pode modular a interação com seus alvos. Outro evento que pode influenciar nas interações de PII é a sua uridililação, que responde aos níveis de nitrogênio. Recentemente, 125 proteínas de Azospirillum brasilense foram descritas como potencias alvos de interação da proteína PII GlnZ, em diferentes vias metabólicas. O objetivo deste trabalho foi validar alguns desses potenciais alvos, através da clonagem e expressão heteróloga dessas proteínas para posteriores ensaios de interação por coprecipitação in vitro. Como resultados, não foram visualizadas interações entre GlnZ e RpoN ou EIIANtr de A. brasilense FP2. Por outro lado, GlnZ foi capaz de formar complexos, na presença de ATP ou ADP, com uma diguanilato ciclase e uma fosfodiesterase de A. brasilense Sp245, enzimas envolvidas na síntese e degradação, respectivamente, do diguanilato cíclico (c-di-GMP), um importante segundo mensageiro em bactérias. A formação dos complexos DGC/GlnZ e PDE/GlnZ foi inibida pela adição de 2-OG junto ao ATP, de maneira dependente da concentração de 2-OG. A uridililação de GlnZ, entretanto, não aparentou influenciar nas interações. Os resultados sugerem que a interação de GlnZ com DGC ou PDE parece ser mais responsiva ao metabolismo de carbono do que ao de nitrogênio, e que essas interações podem influenciar a sinalização por c-di-GMP. Palavras-chave: Proteínas PII. Diguanilato ciclase. Fosfodiesterase. Interação proteína-proteína.

Abstract : The PII protein family is present in bacteria, archea and plants, and can modulate the activity of other proteins through protein-protein interactions. For this reason, they coordinate cellular processes that are mainly related to nitrogen metabolism. The PII binding to the effectors ATP, ADP and 2-oxoglutarate (2-OG) changes its conformation and, consequently, can modulate the interaction with their targets. Another event that can influence the PII interactions is its uridylilation, which is controlled by nitrogen levels. Recently, 125 proteins of Azospirillum brasilense were described as potential interaction targets of the GlnZ PII protein, in different metabolic pathways. The objective of this work was to validate some of these potential targets through the cloning and heterologous expression of these proteins, followed by in vitro co-precipitation assays. As result, no interactions between GlnZ and RpoN or EIIANtr of A. brasilense FP2 were visualized. On the other hand, GlnZ was able to interact, in the presence of ATP or ADP, with a diguanylate cyclase and a phosphodiesterase of A. brasilense Sp245, enzymes involved in the synthesis and degradation of cyclic diguanylate (c-di-GMP), an important second messenger in bacteria. The formation of the DGC/GlnZ and PDE/GlnZ complexes was inhibited by the 2-OG in the presence of ATP, in a 2-OG concentration-dependent manner. GlnZ uridylilation, however, did not appear to influence the interactions. The results suggest that the interaction of GlnZ with DGC or PDE is more responsive to carbon than to nitrogen metabolism, and that these interactions may influence c-di-GMP signaling. Key-words: PII proteins. Diguanylate cyclase. Phosphodiesterase. Proteinprotein interaction.