Avaliação de danos e raparo do DNA em células de melanoma com diferentes conteúdos de melanina submetidas à terapia fotodinâmica

Abstract

Resumo: O melanona é uma neoplasia com incidência crescente, considerado o mais agressivo entre os tipos de câncer de pele e o que possui maior letalidade. Este tipo de tumor é originado nos melanócitos, células produtoras de melanina que é o pigmento que confere coloração à pele e possui um papel protetor em relação ao principal agente etiológico do melanoma, a radiação solar. No entanto, estudos vêm demostrando que a fotoproteção da melanina está mais relacionada aos raios UVB, principalmente pela absorção dessa radiação. Já em relação aos raios UVA e a luz visível, a melanina poderia estar relacionada à promoção de danos às biomoléculas, produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) quando irradiada, sendo o oxigênio molecular singlete (1O2) uma das espécies formadas. A formação do 1O2 também é a base para o mecanismo da terapia fotodinâmica (PDT), utilizada para o tratamento de diferentes tipos de câncer. Contudo, pouco se sabe em relação à resposta adaptativa do tumor após o tratamento com o PDT. O entendimento deste processo poderia auxiliar no melhoramento da terapia para o tratamento do melanoma. Desta forma, o objetivo deste estudo foi investigar danos e reparo do DNA em células de melanoma com diferentes conteúdos de melanina submetidas à fotossensibilização, assim como caracterizar a atividade enzimática da glutationa redutase e glutationa peroxidase após o tratamento. Para isto, as células de melanoma B16-F10 foram estimuladas para produção de melanina com 0,4 mM L-tirosina e 10 mM NH4Cl durante 48 h. Após a incubação de 2 h com 10 ?g.mL-1 do fotossensibilizador Rosa Bengala Acetato (RBAc), as células foram irradiadas por 15 minutos (lâmpadas de LED - 1.5 J/cm2 dose total de luz), avaliadas imediatamente após este tratamento e após 18 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT, o qual mostrou redução da viabilidade em quase 60% nas células com maior quantidade de melanina que foram tratadas com RBAc-PDT, comparada com uma redução de 14% para as células não-estimuladas e submetidas a RBAc-PDT. A análise pelo método do Cristal Violeta mostrou resultados similares, mas menos intensos na redução da viabilidade celular. A avaliação dos danos ao DNA foi realizada pelo ensaio Cometa, com a utilização de enzimas de reparo, que permitem a avaliação de danos oxidativos do tipo 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxodGuo) e de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD). Quando as análises foram feitas imediatamente após a irradiação, ambos os danos foram maiores nas células estimuladas para a melanogênese, incubadas com RBAc e fotossensibilizadas, o que indica que a presença do 1O2 e da melanina favoreceram tanto a formação de 8-oxodGuo como a formação de CPD. No entanto, após 18 h, o dano do tipo 8-oxodGuo aumentou em relação ao tempo inicial, o que demostra que a melanina pode estar impedindo o reparo desta lesão e ainda promovendo sua formação pós-PDT. Já o dano do tipo CPD diminuiu, provavelmente devido ao reparo. Também foi avaliada a atividade enzimática da glutationa redutase e glutationa peroxidase. Observou-se que, após 18 h, a atividade de ambas as enzimas diminuiu em relação aos controles. Os dados obtidos apontam o envolvimento da melanina na geração de danos ao DNA quando submetida à RBAc-PDT e a permanência do dano 8-oxodGuo na células com melanogênese estimulada, a implicação desses resultados na instabilidade genômica da célula tumoral e no desenvolvemento de resistência à terapia ainda precisam ser melhor investigados. Palavras-chave: Melanina.Oxigênio Singlete.Danos ao DNA.Enzimas antioxidantes.

Abstract: Melanoma is a neoplasm with increasing incidence, considered the most aggressive among skin cancers and the one with the highest lethality. This type of tumor originates in melanocytes, cells that produce melanin which is the pigment that gives color to the skin and has a protective role in relation to the main etiological agent of melanoma, solar radiation. However, studies have shown that the photoprotection of melanin is more related to UVB rays, mainly by the absorption of this radiation. In relation to UVA and visible light, melanin could be related to the promotion of damage to biomolecules, producing reactive oxygen species (ROS) when irradiated, with the formation of singlet molecular oxygen (1O2). The formation of 1O2 is also the basis of the mechanism of photodynamic therapy (PDT), used for the treatment of different types of cancer. However, little is known about the adaptive response of the tumor after treatment with PDT. The understanding of this process could aid in the improvement of therapy for the treatment of melanoma. Thus, the objective of this study was to investigate DNA damage and repair in melanoma cells with different melanin contents submitted to photosensitization, as well as to characterize the activity of glutathione reductase and glutathione peroxidase after treatment. For this, B16-F10 melanoma cells were stimulated to produce melanin with 0.4 mM L-tyrosine and 10 mM NH4Cl for 48 h. After 2 h-incubation with 10 ?g.mL-1 of the photosensitizer Rose Bengal Acetate (RBAc), the cells were irradiated for 15 minutes (LED lamps - 1.5 J/cm2 total light dose), evaluated immediately after this treatment and after 18 h. Cell viability was evaluated by MTT, which showed a reduction of almost 60% in viability of cells with the highest amount of melanin treated with RBAc-PDT compared to a reduction of 14% for non-stimulated cells submitted to RBAc-PDT. Analysis by Crystal Violet method showed similar, but less intense reduction on cell viability. The evaluation of DNA damage was performed by the Comet assay, using repair enzymes, which allow the evaluation of oxidative damage 8-oxo-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo) and pyrimidine cyclobutane dimers (CPD). When analyses were performed immediately after irradiation, both damages were greater in cells stimulated for melanogenesis, incubated with RBAc and photosensitized, indicating that the presence of 1O2 and melanin favored both the formation of 8-oxoduo as the formation of CPD. However, after 18 h, 8-oxodGuo damage increased compared to the initial time, which shows that melanin may be preventing the repair of the lesion and still promoting its post-PDT formation. The CPD damage type decreased, probably due to the repair. The enzymatic activity of glutathione reductase and glutathione peroxidase was also evaluated. It was observed that, after 18 h, the activity of both enzymes decreased relative to controls. The data obtained indicate the involvement of melanin in the generation of DNA damage when submitted to RBAc-PDT and the permanence of 8-oxodGuo damage in cells with stimulated melanogenesis, the implication of these results in tumor cell genomic instability and the development of resistance still need to be better investigated. Key-words: Melanin.Oxygen Singlete.Damage to DNA.Antioxidant enzymes