Bioprospecção de Fonsecaea pedrosoi em amostras ambientais por amplificação em círculo rolante (RCA)

Abstract

Resumo: As Leveduras negras sao fungos ascomicetos pigmentados de desenvolvimento lento predominatemente leveduriforme que ocupam diversos nichos ecológicos nos ecossistemas. As especies associadas a infecções em hospedeiros humanos e animais estão taxonomicamente acomodadas na ordem Chaetothyriales dentro da família Herpotrichiellaceae, reunindo entre outros os agentes causais da doença cromoblastomicose, uma micose subcutânea crônica, caracterizada pela presença de corpos muriformes no tecido hospedeiro. Dados epidemiológicos demonstram que a infecção ocorre por implantação frequentemente associada a um trauma por fragmentos vegetais. A região norte do Brasil é considerada área endêmica da doença, principalmente devido às características ocupacionais predominantemente rurais e extrativistas da população. O maior agente etiológico da cromoblastomicose é a espécie Fonsecaea pedrosoi, porém sua recuperação de substratos ambientais é restrita. Neste contexto, o objetivo principal deste estudo foi a investigação ambiental de F. pedrosoi em diversos nichos e substratos, atraves de amostras procedentes de áreas endêmicas da doença, por meio de ferramentas moleculares e métodos específicos de isolamento. Um total de 87 amostras foi analisado por ambos os métodos. Para o screening molecular foi aplicado o método de sonda cadeado baseado na técnica de Amplificação em Círculo Rolante (RCA) no DNA total das amostras estudadas. O agente de cromoblastomicose F. pedrosoi foi detectado pela sonda e amplificado por RCA em amostras de solo, material em decomposição e folha da planta Solanum paniculatum (jurubeba). O limite de detecção do método foi de 2.88x107 cópias do DNA de interesse. Para o isolamento foi utilizado o metodo seletivo de flotação em óleo mineral e a identificação dos isolados foi realizada por marcadores morfológicos e moleculares. Através do isolamento foram recuperadas 175 colônias negras, sendo 08 isolados morfologicamente semelhantes aos agentes de cromoblastomicose, identificados molecularmente como F. multimorphosa (n= 01), F. brasiliensis (n=04), C. ambígua (n=02) e C. guayanensis (n=01). Das amostras selecionadas pelo método molecular não foi possivel recuperar nenhuma linhagem de especies relacionadas à doença cromoblastomicose. Este foi o primeiro estudo a utilizar o método de sonda cadeado baseado em RCA como ferramenta de seleção ambiental o qual demonstrou a presença do DNA de F. pedrosoi em plantas. Entretanto, a baixa taxa de desenvolvimento e a natureza oligotrófica das espécies patogênicas, pode limitar a recuperação por métodos de isolamento, justificando a limitação do método e não recuperação das espécies patógenas das amostras positivas. Em conclusão, a sonda cadeado baseada em RCA é uma ferramenta adicional nos estudos destes agentes, a qual pode contribuir para inferência de dados sobre rotas de infeção da cromoblastomicose e da ocorrência ambiental destes patógenos. Palavras-chave: Leveduras negras. Sonda cadeado. Detecção ambiental. Chaetothyriales. Cromoblastomicose.

Abstract: Black yeasts are melanized ascomycetous fungi, predominantly yeast-like, present in many ecological niches and ecosystems. The species associated with human and animal infections belong to the Chaetothyriales order, Herpotrichiellaceae family. Chromoblastomycosis is a chronic subcutaneous mycosis characterized by the presence of muriform cells in the host tissue. Epidemiological data demonstrate that the infection occurs by the implantation of the black yeast by trauma with plant fragments. The northern region of Brazil is an endemic area of the disease, due to the predominantly rural and extractive occupational characteristics of the population. The major etiological agent of chromoblastomycosis is Fonsecaea pedrosoi, but its recovery from environmental substrates is restricted. In this context, this study aim to investigate the presence of F. pedrosoi in several ecological niches and substrates from endemic areas of chromoblastomycosis by molecular tools and isolation by flotation in mineral oil. A total of 87 samples were analyzed for both methods. For the molecular screening, we applied the padlock probe based on the Rolling Circle Amplification (RCA) in the total DNA of the samples studied. Fonsecaea pedrosoi was detected by the padlock probe and RCA in soil, decomposing plant material and leaf of the plant Solanum paniculatum (jurubeba). The limit of detection of this method was 2.88×107 copies of the DNA. The selective method of flotation in mineral oil was performed and the isolates were idenfied by morphological and molecular markers. A total of 175 black colonies were recovered, 8 were macro and micromorphology similar to chromoblastomycosis agents and were identified by molecular methods as F. multimorphosa (n = 1), F. brasiliensis (n = 4), C. ambigua (n = 2) and C. guayanensis (n = 1). From the samples positive by the molecular method, no chromoblastomycosis agents were isolated. This was the first study to use padlock probe based on RCA for environmental detection of F. pedrosoi DNA in plants. In addition, the low development and the oligotrophic nature of the pathogenic species may limit the isolation by conventional techniques. In conclusion, the padlock probe based on RCA is an additional tool for these agents studies and contributes to elucidate the infection routes of chromoblastomycosis and environmental occurrence of these pathogens. Key-words: Black yeasts. Padlock Probe. Evironmental detection. Chaetothyriales, Chromoblastomycosis.