Caracterização de estirpes de Azospirillum brasilense contendo proteína NifA deletada no domínio GAF

Abstract

Resumo: Azospirillum brasilense é uma bactéria fixadora de nitrogênio que se associa com diversas plantas de interesse agrícola, como milho e trigo, apresentando potencial de aplicação como biofertilizante. O processo denominado fixação biológica de nitrogênio, catalisado pelo complexo da nitrogenase, requer uma grande quantidade de energia pela hidrólise de 16 moléculas de ATP para cada molécula de N2 reduzida e sua regulação a nível transcricional é centrada na atividade da proteína NifA, o ativador específico da transcrição dos genes nif. Esta proteína apresenta no seu domínio N-terminal (GAF) um papel regulatório, o qual previne a atividade de NifA na presença de amônio. Além disso, a regulação a nível pós-traducional da nitrogenase envolve a ADP-ribosilação e inativação reversível da proteína NifH sob altos níveis de amônio, reação catalisada pela enzima dinitrogenase redutase ADP-ribosiltransferase (DraT). Neste trabalho foram construídas duas estirpes mutantes de A. brasilense, TAFP e TAHM, ambas contendo deleção cromossomal da região 5' do gene nifA correspondente ao domínio N-terminal de NifA. Quatro duplo-mutantes de ambas as estirpes foram selecionados baseado na capacidade de crescer na presença de sacarose. Ensaios de atividade da nitrogenase mostraram que a deleção cromossomal do domínio N-terminal de NifA resultou em uma proteína incapaz de ativar a transcrição dos genes nif, mesmo em baixos níveis de amônio, fenótipo confirmado pela ausência de expressão da fusão transcricional nifB::lacZ. Estes resultados sugerem que a região deletada do gene nifA parece ser importante para a estabilidade ou conformação ativa da proteína. As estirpes mutantes foram complementadas para atividade da nitrogenase com plasmídeos expressando a proteína nativa ou uma outra versão N-truncada de NifA. Transconjugantes de ambos os plasmídeos foram capazes de restaurar o fenótipo de fixação de nitrogênio e, além disso, aqueles possuindo a proteína N-truncada sendo expressa apresentaram atividade mesmo na presença de íons amônios. Os ensaios de complementação mostraram que outros pontos de truncamento resultam em uma NifA ativa mesmo na presença de amônio e são potenciais alvos para deleção cromossomal. Palavras-chave: Fixação biológica de nitrogênio, Azospirillum brasilense, proteína NifA.

Abstract: Azospirillum brasilense is a nitrogen-fixing bacterium which is associated with several plants of agricultural interest, such as corn and wheat, presenting potential application as biofertilizer. Biological nitrogen fixation, catalyzed by the nitrogenase complex, requires a large amount of energy by the hydrolysis of 16 ATP molecules for each reduced N2 molecule and its transcriptional regulation level in A. brasilense is centered on the activity of NifA, the specific activator of nif genes transcription. This protein presents in its N-terminal domain (GAF) a regulatory role, which prevents NifA activity in the presence of ammonium. Furthermore, post-translational regulation level of nitrogenase activity involves ADP-ribosylation and reversible inactivation of NifH protein under high ammonium conditions, a reaction catalyzed by the dinitrogenase reductase ADP-ribosyltransferase enzyme (DraT). In this work two mutant strains of A. brasilense, TAFP and TAHM, were constructed, both containing chromosomal deletion of the 5' region of the nifA gene corresponding to the N-terminal domain of NifA. Four double-mutants of both strains were selected based on their ability to grow in the presence of sucrose. Nitrogenase activity assays revealed that chromosomal deletion of NifA N-terminal domain resulted in a protein unable to activate the transcription of nif genes even at low ammonium levels, which was confirmed by the absence of nifB::lacZ transcriptional fusion expression. These results suggest that the deleted region of the nifA gene seems to be important for protein stability or active conformation. The mutant strains were complemented for nitrogenase activity with plasmids expressing the native or another N-truncated version of the NifA protein. Transconjugants from both plasmids were able to restore the nitrogen fixation phenotype and, in addition, those containing the N-truncated protein being expressed showed activity even in the presence of ammonium ions. Mutant complementation assays have shown that other truncation sites result in active NifA even in the presence of ammonium and are potential targets for chromosomal deletion. Keywords: Biological Nitrogen Fixation, Azospirillum brasilense, NifA Protein.