Construção e caracterização de um diabody específico contra toxinas do veneno de Loxosceles intermedia

Abstract

Resumo: Aranhas do gênero Loxosceles possuem distribuição mundial e são consideradas de grande importância médica. O envenenamento (loxoscelismo) pode resultar em lesões dermonecróticas, falência renal, desordens hematológicas e, em crianças, pode ser fatal. No Brasil, o loxoscelismo é considerado um sério problema de saúde pública causado por 3 principais espécies (L. intermedia, L. gaucho, L. laeta), responsáveis por mais de 6.000 casos/ano. O perfil de envenenamento pode variar conforme as características da aranha ou do paciente e a soroterapia, a partir da imunização do cavalo, ainda é utilizada há décadas como tratamento específico. Atualmente, tem-se como terapia para diversas doenças o uso de fragmentos únicos de cadeias variáveis (scFv) de anticorpos que podem ser obtidos a partir de tecnologia recombinante. Esses fragmentos são candidatos ideais para a neutralização de substâncias tóxicas provenientes de envenenamento, pois possuem baixa massa molecular, rápida difusão no tecido e são estáveis. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho é desenhar um anticorpo recombinante (LimAb7 diabody) a partir do monoclonal murino LimAb7 já caracterizado previamente. Para tanto, fez-se necessário realizar a clonagem a partir do cDNA obtidos de hibridomas secretores de LimAb7 e expressar o recombinante em bactérias E. coli AD494. ELISA, Imunoblotting, inibição da atividade de esfingomielinase pelo kit Amplex Red® e neutralização de hemólise foram realizados com intuito de avaliar a capacidade funcional da molécula recombinante. Pode-se observar por Western blotting que, o LimAb7 diabody reconhece proteínas de aproximadamente 30kDa, sendo consideradas as responsáveis por causarem dermonecrose. Verificou-se também que o recombinante neutraliza a atividade esfingomielinásica do veneno e dessa forma, inibe a hemólise induzida pela ação do mesmo. Com isso, os resultados mostraram-se promissores para que o anticorpo recombinante possa vir a ser utilizado nos acidentes loxoscélicos. Palavras chave: scFv, aranha marrom, anticorpo recombinante, antiveneno

Abstract: Spiders of the genus Loxosceles have worldwide distribution and are considered of great medical importance. Poisoning (loxoscelism) can result in dermonecrotic injuries, renal failure, hematological disorders, and maybe fatal in children. The loxoscelism is considered a serious public health problem in Brazil where three main species are found (L. intermedia, L. gaucho, L. laeta) account for more than 6,000 cases / year. Poisoning profile can be varied according to the characteristics of the spider or the patient. The horse antivenom has been still used for decades as a specific treatment. Currently, it is thought therapy for various diseases using single chain variable fragments (scFv) antibodies which can be obtained from recombinant technology. These fragments are ideal candidates for the neutralization of toxic poisoning from substances because they have low molecular weight, rapid diffusion in the tissue and are stable. In this context, the aim of this work was to design a recombinant antibody (LimAb7 diabody) from a murine monoclonal LimAb7 previously characterized as a neutralizing molecule. Therefore, it was necessary to perform cloning from cDNA of LimAb7 secreting hybridomas and the expression of recombinant protein in E. coli AD494 . ELISA, immunoblotting, inhibition of sphingomyelinase activity by Amplex Red kit and hemolysis neutralization assay were performed in order to assess the functional capacity of the recombinant molecule. It was possible to verify Western blotting that the LimAb7 diabody recognizes a 30kDa protein, considered as being responsible for causing dermonecrosis. It was also found that the recombinant antibody neutralizes sphingomyelinase activity and thus inhibits the hemolysis induced by the venom. Thus, based on the results, the recombinant antibody therapy may have promising potential in in loxoscelic accidents. Keywords: scFv, brown spider, recombinant antibody, antivenom