O papel de TGHDAC-2 em Toxoplasma gondii

Abstract

Resumo : Toxoplasma gondii pertence ao filo Apicomplexa e é o agente causador da toxoplasmose. Seu ciclo de vida é bastante complexo e alterna entre o seu hospedeiro definitivo, felinos, e o hospedeiro intermediário, animas de sangue quente, incluindo o homem. As formas de vida do parasita possuem diferentes perfis de expressão gênica que são fundamentais para a virulência e como mecanismo de adaptação nos diferentes hospedeiros. Nos últimos 15 anos, fatores epigenéticos tem sido associados como parte fundamental do controle da expressão gênica nestes parasitas, dentre eles a modificação em histonas que tem um papel especial na regulação gênica do parasita. T. gondii possui as 4 histonas canônicas conservadas, além de diversas enzimas remodeladoras de cromatina, que ordenadamente adicionam ou removem modificações pós-traducionais em histonas, afetando a arquitetura da cromatina e processos dependentes de DNA. Entre elas encontram-se as deacetilases de histona (HDACs), que removem o grupo acetil de lisinas acetiladas em histonas, e consequentemente tornam a cromatina mais compactada, silenciando a expressão dos genes. T. gondii possui sete HDACs, dentre elas a HDAC-2 que é o objeto do presente estudo.. Embora seja aparentemente uma HDAC clássica de classe I e similar aos demais eucariotos, a HDAC-2 de T. gondii possui duas inserções nucleotídicas que acrescentam 170 nucleotídeos dentro do domínio HDAC característico, que a tornam única de parasita do filo Apicomplexa e cuja função permanece desconhecida. Além disso, a expressão de HDAC-2 encontra-se aumentada durante a fase S do ciclo celular, conforme resultados presentes no banco de dados. Por ser tão singular, o objetivo principal desta pesquisa foi caracterizar a Histona Deacetilase-2 de Toxoplasma gondii, sua localização celular, bem como seu papel em processos dependentes de DNA, como replicação e regulação da expressão gênica do parasita. Para tanto, partimos para ensaios de etiquetamento da proteína endógena, utilizando uma repetição de 3x HA para localização da proteína por imunofluorescência. Porém após inúmeras tentativas de transfecção na cepa RH ?HX?Ku80 de T. gondii, não foi possível obter mutantes com a proteína etiquetada, e com isso os objetivos de identificar complexos e genes a ela associados não foram possíveis até o momento. Entretanto, o nocaute gênico foi obtido com sucesso por PCR de fusão, utilizando as regiões adjacentes ao gene hdac-2. Análises preliminares de imunofluorescência revelaram que parasitas HDAC-2 KO falham em deacetilar mais especificamente a histona H4, e não a histona H3. Adicionalmente, por meio de ensaio de formação de placa, observamos que as placas de lise nos parasitas KO são menores e em menor número, um dado que sugere que essa deacetilase está relacionada à replicação do parasita e possivelmente afete sua virulência. Confirmamos que o mRNA de hdac-2 possui splicing alternativo retendo o primeiro íntron. Até o momento, nossos dados indicam uma participação de HDAC-2 no processo de replicação do parasita, envolvendo possivelmente a deacetilação da histona H4, embora mais estudos devem ser feitos a fim de elucidar a função dessa deacetilase atípica em T. gondii.