Expressão de gtpases recombinates : purificação e uso em enssaios de pull-down

Abstract

Resumo : A GTPase Rnd1 é um membro da família Rho de GTPases que apresenta a peculiaridade de estar constitutivamente em seu estado ativo (ligado a GTP). Seu papel na célula está ligado à plasticidade do citoesqueleto, com especial importância no desenvolvimento do sistema nervoso. A proteína STI-1, assim como a Rnd1, é expressa em neurônios e células da glia. Dentre suas funções estão neuroproteção, neuritogênese, dobramento de proteínas (é uma co-chaperona), e, mais recentemente, regulação do citoesqueleto. Considerando o papel desempenhado pelas duas proteínas no desenvolvimento do sistema nervoso, e a literatura científica atual, levantou-se a hipótese de que as duas pudessem atuar em conjunto, e que STI1 possivelmente seria responsável por regular a atividade da Rnd1. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar uma possível interação in vitro entre Rnd1 e STI1. Para tanto, foram expressas em sistema heterólogo de E. coli as GTPases recombinantes Rnd1, Rnd2, e RhoD, previamente clonadas em vetores pGEX 4T2, que confere um tag de GST. Tais proteínas foram imobilizadas em matriz sólida de Glutationa-Sepharose e incubadas com extratos totais de encéfalo de camundongos para ensaios de pulldown. As proteínas foram eluídas das matrizes com tampão de amostra. Os eluatos foram então analisados em SDS-PAGE e western blotting com os anticorpos específicos anti-GST e anti-STI1. Os resultados evidenciaram interação específica entre GST-Rnd1 e STI1. As três proteínas citadas foram também expressas em larga escala e purificadas, para ensaios bioquímicos futuros.