Terapia gênica na proteção de ilhotas de Langerhans utilizando survinina

Abstract

Resumo: Este estudo avaliou o efeito da survivina, uma das proteínas inibidoras da apoptose (PIAs), no prolongamento da sobrevida e na diminuição de apoptose de ilhotas de Langerhans in vitro e in vivo. Transduziram-se ilhotas isoladas de camundongos Balb/c durante um período de doze horas com o gene survivina utilizando-se um adenovírus defectivo como vetor viral (pAd) associado à proteína verde fluorescente (GFP). Avaliou-se a expressão ideal da survivina com imunoblot e fluorescência direta, submetendo-se, além disso, ilhotas transduzidas à imunoistoquímica para avaliação da penetração do vetor viral e da survivina na estrutura insular. Submeteram-se a teste de secreção de insulina por radioimunoensaio ilhotas com adequada expressão de survivina para se avaliarem os possíveis efeitos dessa proteína na função insular. Analisou-se a incidência de apoptose em ilhotas por estímulo citotóxico, mediante adição de citoquinas, e método de colorimetria. Apoptose foi também mensurada utilizando-se análise histológica de morfologia nuclear recorrendo-se a coloração nuclear específica DAPI em ilhotas transduzidas e submetidas à hipóxia e à privação de nutrientes. No modelo in vivo, efetuaram-se transplantes singênicos, contendo quantidade marginal de ilhotas transduzidas com o gene survivina, em camundongos C57Bl/6 quimicamente diabéticos. Transplantes de ilhotas alogênicos com massa ideal, transduzidos com survivina e provenientes de camundongos Balb/c foram efetuados em camundongos C57Bl/6 e NOD/Scid quimicamente diabéticos na ausência de imunossupressão. Ilhotas não transduzidas ou contendo apenas vetor viral e GFP serviram como controle. Criou-se um camundongo NOD/Ltj transgênico para survivina com expressão aumentada dessa proteína nas ilhotas pancreáticas e estudou-se a incidência de diabetes em comparação ao grupo do tipo selvagem, que desenvolve diabetes do tipo autoimune em 100% das fêmeas na idade de 25 semanas. A dose de pAd-survivina-GFP com boa expressão da proteína, evidenciada tanto por imunoblot como por fluorescência, que não afetou a função de ilhotas isoladas foi de 2.5x107 unidades formadoras de infecção (UFI), utilizada nas etapas posteriores deste estudo. A expressão de survivina associou-se à diminuição do índice apoptótico em ilhotas submetidas a estresse citotóxico (5.9%-pAd-survivina-GFP vs. 44%-pAd-GFP e 50%-controle, p<0.05). A presença de survivina em ilhotas expostas à hipóxia e à privação de nutrientes revelou um índice de morte celular programada três vezes menor quando comparada à morte celular de ilhotas transduzidas com pAd-GFP (21.2%-survivina vs 62.8%-GFP, p<0.05). Camundongos diabéticos receptores de enxertos singênicos marginal de ilhotas transduzidos com survivina apresentaram taxa de glicemia sérica semelhante à verificada em animais não diabéticos, enquanto receptores de enxertos marginais sem tratamento ou transduzidos com GFP apenas permaneceram hiperglicêmicos. Camundongos C57bl/6 receptores de massa ideal de ilhotas alogênicas transduzida com survivina apresentaram aumento significativo na sobrevida do enxerto quando comparado aos grupos controle (p<0.002). Obteve-se em camundongos NOD/Ltj, com sucesso, a expressão transgênica de survivina, associada a um retardamento significativo no desenvolvimento de insulite e de diabetes autoimune. Conclui-se que a survivina atenua o processo de morte celular programada desencadeado por estímulos citotóxicos, isquêmicos e imunológicos em ilhotas de Langerhans, tanto in vitro como in vivo, representando uma alternativa atraente na terapia gênica para tratamento do diabetes.