Avaliação dos requisitos estruturais da molécula de heparina que são necessários para o estímulo da síntese de proteoglicano de heparam sulfato em células endoteliais

Abstract

Resumo : Heparina é um polissacarídeo linear, pertencente à família dos glicosaminoglicanos (GAGs). Ela é formada por unidades repetitivas de dissacarídeos compostas por uma D-glucosamina, que pode ser N-sulfatada ou acetilada e 6-O-sulfatada, ou ainda, raramente 3-O-sulfatada, e um ácido urônico, que pode ser ácido Dglucurônico ou L-idurônico, e este pode apresentar um grupamento sulfato 2-O ligado. Assim, possui cargas negativas decorrente dos grupamentos sulfato e ainda dos grupamentos carboxílicos, presentes nos ácidos urônicos. A ação farmacológica da heparina está mais relacionada com a sua atividade anticoagulante, descrita desde o início do século passado. A heparina age no sistema de coagulação exercendo seu efeito principalmente por ligar-se à antitrombina, formando um complexo ternário, aumentando sua capacidade em inativar várias enzimas da cascata da coagulação. O heparam sulfato é outro GAG, cuja estrutura química é muito parecida com a molécula de heparina, porém com menor grau de sulfatação. Os dados da literatura mostram que o Proteoglicano de Heparam Sulfato (PGHS), presente na superfície das células endoteliais, é o responsável por manter a compatibilidade destas com o sangue, isto é, age impedindo a formação de coágulos. Desta forma, este PGHS já possui uma característica antitrombótica (impede a formação de trombos). Porém, quando essas células são expostas à heparina, em ensaios "in vitro", ocorre um aumento da síntese do PGHS, tornando-o mais sulfatados, e consequentemente, aumentando a atividade antitrombótica. Assim, o objetivo deste trabalho foi entender quais os requisitos estruturais da heparina que são necessários para causar tal efeito. Para tanto, foram realizadas modificações químicas nestas moléculas: carboxirredução e dessulfatação, pontuais, bem como total. Ainda, um lote desta heparina totalmente dessulfatada foi Nacetilada. As modificações foram comprovadas pelo perfil eletroforético em gel de agarose, tampão PDA, dosagem de sulfato e de ácido urônico e por ressonância magnética nuclear (RMN). Para a análise do estímulo da síntese do proteoglicano de heparam sulfato foram utilizadas células endoteliais de aorta de coelho cultivadas na presença, ou não, da heparina e das heparinas modificadas em meio de cultura contendo [35S]–sulfato de sódio. A análise do efeito sobre a síntese do PGHS revelou que a heparina totalmente dessulfatada não estimulou a síntese, porém, quando foi utilizada a heparina totalmente dessulfatada e N-acetilada houve um pequeno estímulo na síntese do PGHS. Para avaliar melhor esse resultado, foi utilizada a técnica do dicroísmo circular (DC), que é capaz de revelar alterações na conformação dessas heparinas modificadas. O resultado mostrou que a heparina totalmente dessulfatada, quando N-Acetilada, exibe uma conformação diferente, quando comparada com a totalmente dessulfatada. Esse conjunto de resultados nos levam a concluir que o estímulo da síntese do proteoglicano de heparam sulfato é decorrente não somente dos grupamentos sulfatos ou da quantidade de cargas negativas (sulfato ou carboxila), mas também da conformação em que estas estão presentes na molécula de heparina.