Análise genética e mutagenese sítio dirigida do gene glnE de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo : GlnE é uma enzima efetora bifuncional que atua regulando a cascata do metabolismo de nitrogênio controlando a atividade da enzima Glutamina Sintetase (GS). GS é uma das enzimas centrais envolvidas na assimilação de nitrogênio catalisando a conversão de glutamato e amônio em glutamina. A proteína GlnE regula a atividade enzimática de GS através da adenililação/desadenilidação de suas subunidades. Em H. seropedicae, uma bactéria diazotrófica endofitica, o gene glnE foi identificado durante o programa de sequenciamento genômico (GENOP AR). Nesse organismo, o gene glnE codifica para uma proteína de 927 aminoácidos que apresenta alta similaridade com o gene glnE de outros organismos. O gene glnE é, aparentemente, monocistrônico e constitutivamente expresso. Dois domínios homólogos conservados foram identificados na proteína GlnE: um na região Cterminal que possui o sítio de desadenililação e outro na região C-terminal que possui o sítio de adenililação. Um cassete de canamicina foi clnserido no gene glnE clonado no vetor pUC18. O plasmídeo resultante (PHF16), foi eletroporado na estirpe selvagem SMRl de H seropedicae gerando duas estirpes mutantes por inserção cromossomal (HEL 1 e HEL2). O mutante HEL 1 apresentou atividade nitrogenase reduzida em relação à estirpe selvagem SMRl.