Clonagem, superexpressao e purificaçao de uma proteína mutante de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo : Herbaspirillum seropedicae é um diazotrofo endofítico que foi inicialmente isolado de gramíneas. Neste organismo, a fixação de nitrogênio é regulada positivamente pela proteína NifA. A proteína PII, produto do gene g/nB, possui um papel central nesta regulação. Dados de difração de raios-X mostraram que a proteína PII de H. seropedicae apresenta um motivo estrutural em hélice 310 a partir do resíduo Gly 108, na região C-terminal, que está ausente na proteína PII de E. colí, porém presente na proteína GlnK (paráloga à PII). De fato, a proteína PII de H. seropedicae parece ser funcionalmente semelhante a proteína GlnK de E. co/i. Enquanto a proteína GlnK de E. calí controla indiretamente a atividade de NifA, aliviando a inibição de NifL sobre NifA em condições de desrepressão, a PII de H. seropedicae parece controlar diretamente a atividade de NifA. Estes dados sugerem que a região C-terminal da proteína PII de H. seropedicae pode estar envolvida no controle da atividade de NifA. Para avaliar a importância funcional da região C-terminal da proteína PII de H. seropedicae foram construídos dois mutantes do gene g/nB. Em um dos mutantes, obtido por mutagênese sítio dirigida, os resíduos Gly108 e Pro109 foram substituídos por resíduos de alanina e esta proteína foi denominada PII-AA. O outro gene mutante, obtido por mutagênese aleatória, apresenta quatro substituições de resíduos: Gln3-Arg; Thr5- Ala; Gly87-Cys; Gly108-Trp e codifica para a proteína PII-AL. Os genes g/nB mutantes foram clonados no vetor de expressão pET28b+, originando os plasmídeos pACB3 e pACB51, respectivamente. O sequenciamento destes genes mostrou que o mutante aleatório apresenta a deleção de um nucleotídeo que torna o gene não funcional. A proteína PII-AA foi superexpressa a partir do plasmídeo pACB3 e purificada por cromatografia de troca iônica e de afinidade.