Modulação da atividade da H+atpase do tipo vacuolar presente num modelo de célula intercalar renal (células MDCK - C11) : efeito sobre a atividade atpásica e a concentração intracelular de cálcio

Abstract

Resumo : As células intercalares presentes no segmento conector e no ducto coletor do rim de mamíferos apresentam a capacidade de secretar prótons de forma ativa, utilizando duas ATPases, a H+ ATPase do tipo vacuolar e uma H+ -K+ ATPase. Trabalhos recentes do nosso laboratório têm demonstrado que o subclone C11 das células MDCK possui mecanismos de secreção de prótons semelhantes aos encontrados nas células intercalares do ducto coletor. Neste estudo tivemos como objetivo principal dar continuidade à caracterização funcional das ATPases secretoras de prótons presentes nestas células; em especial estudar o efeito do hormônio antidiurético (i.e., vasopressina) e de um incremento na concentração extracelular de K+ (hipercalemia). Nos experimentos foram utilizadas células MDCK C11 (passagem 76 a 86) semeadas em placas de seis wells a uma densidade de 106 células/cm3 . Nos experimentos em que estudamos o efeito da hipercalemia sobre a atividade ATPásica a concentração de K+ no meio de cultivo foi incrementada de 5mM a 9mM, nas 24 horas prévias ao experimento ou desde o momento das células serem semeadas (48 a 72h). Após a confluência as células foram removidas e a atividade bioquímica das H+ ATPases foi determinada em um homogenado contendo todas as estruturas celulares por um método colorimétrico modificado do descrito por Fiske-Subarow. A atividade da H+ ATPase vacuolar foi calculada pela diferença entre o Pi liberado na ausência e na presença de bafilomicina A1 ou concanamicina 10-8M, a presença da H+ -K+ ATPase foi determinada a partir da sensibilidade a Vanadato 1mM (inibidor de ATPases do tipo P). Num grupo de experimentos a concentração intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) foi determinada por fluorometria utilizando o probe FLUO 4. A atividade da H+ ATPase vacuolar foi estimulada de forma significativa por uma dose fisiológica de vassopresina (10-11) (7,93±0,55nmol Pi.mg-1.min-1 com ADH vs 4,87±0,50 no basal, n=17), mas não foi alterada por uma dose suprafisiológica (10-9M) (4,47±0,71nmol Pi.mg-1.min-1 com ADH 10-9M vs 5,25±0,94 no basal, n=19). Nos experimentos realizados para avaliar as modificações na [Ca2+]i a vasopressina 10-9M induziu um incremento significativo do sinal fluorescente, o que indica um incremento significativo na [Ca2+]i. Em relação aos níveis controle o incremento médio foi de 324.99±32.42%, p=0.02 (n=3). Com a adição de K+ 9mM diretamente no meio de cultivo 24h antes do experimento, observou-se um incremento não significativo tanto na atividade da H+ ATPase vacuolar: 7,45±3,05nmol Pi.mg-1.min-1 com K+ 9mM vs 5,17±1,69 no basal (5mM), n=7; quanto na atividade da H+ -K+ ATPase: 9,30±2,02nmol Pi.mg-1.min-1 com K+ 9mM vs 8,04±1,55 no basal (5mM), n=7). Já a incubação com K+ a 9mM por 48h-72h estimulou de forma significativa a atividade da H+ ATPase vacuolar: 17,56±3,56nmol Pi.mg-1.min-1 com K+ 9mM vs 8,11±1,68 no basal (5mM), n=9, p= 0,03. Por outro lado, a atividade da H+ -K+ ATPase não apresentou uma modificação significativa: 20,24±4,32nmol Pi.mg-1.min-1 com K+ 9mM vs 11,32±2,59 no basal (5mM), n=10, p= 0,09. Os resultados obtidos nos permitem afirmar que a atividade da H+ ATPase do tipo vacuolar presente nas células MDCK C11 é estimulada de forma significativa com a adição de ADH a doses fisiológicas (10-11M), e por uma hipercalemia de no mínimo 48-72 horas.